Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. MEA Kurulumunun Hazırlanması
Not: Kayıttan 15 dakika önce başlayın.
- Kalan 4AP-ACSF (4-aminopiridin yapay beyin omurilik sıvısı) hacmini 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın.
- Erlenmeyer şişesini MEA (Mikroelektrot dizileri) amplifikatörünün üzerindeki bir rafa yerleştirin ve çözeltinin sürekli olarak 60 mL'lik bir şırıngayı beslemesine izin vermek için boru kullanın. Erlenmeyer şişesinin ve şırınganın yüksekliğini 1 mL/dk.
yerçekimi beslemeli bir hıza izin verecek şekilde ayarlayın
not: Doğru yükseklik, boru iç çapına (ID) bağlıdır. 5/32 inç iç çaptaki borular için 30 cm yeterlidir.
- 4AP-ACSF'yi Erlenmeyer şişesinde ve şırıngada %95 O2/5% CO2 gaz karışımı ile köpürtmeye başlayın.
- 4AP-ACSF'nin perfüzyon tüpünden içinde hava kalmayana kadar bir behere akmasına izin verin; sonra çözelti akışını durdurun.
- MEA tabanındaki ısıtma elemanını termostata bağlayın. Kuru MEA çipini MEA'nın içine yerleştirin amplifier ve amplifikatör kafasını sabitleyin. Plastik bir Pasteur pipeti, 4AP-ACSF'yi kayıt odasının girişine ve dış rezervuarına aktarır.
- Isıtma kanülünü manyetik bir tutucuya sabitleyin ve ucunu kayıt odası giriş portunun içine yerleştirin. Manyetik tutucuyu MEA üzerindeki manyetik bir şeride takın. Perfüzyon tüpünü kanüle bağlayın. Kanülü termostata bağlayın.
not: Isıtma kanülü, kayıt odası giriş portuna ulaşmak ve metalik malzemesi nedeniyle gürültüyü en aza indirmek için eğimli politetrafloroetilen (PTFE) boru ile kapatılmalıdır. Giriş rezervuarı 4AP-ACSF ile yeterince doldurulduğunda, perfüzyon sisteminden düşen damlalar görünmemelidir.
- Emme iğnesini rezervuarın içine yerleştirin ve ACSF'ye daldırarak negatif basınç olduğunu doğrulayın; sabit bir düşük frekanslı emme gürültüsü olup olmadığını kontrol edin.
not: Emme iğnesi, 4AP-ACSF beyin dilimi yüzeyinin hemen üzerine akacak şekilde yerleştirilmelidir. Bir vakum hattı veya düşük gürültülü bir vakum pompası kullanılabilir.
- Akış regülatörünü 1 mL/dk'lık bir akış hızına izin verecek şekilde ayarlayın ve perfüzlemeye başlayın.
not: Yerçekimi beslemeli perfüzyon, peristaltik pompaların neden olabileceği gürültüyü ortadan kaldırır; Peristaltik pompalar tercih edilirse, düşük gürültülü modeller zorunludur.
- 4AP-ACSF kanülden akmaya başladığında termostatı açın. Kayıt odası içinde 32 - 34 °C'lik bir sıcaklık elde etmek için ısıtma kanülünü 37 °C'ye ve MEA tabanını 32 °C'ye ayarlayın.
NOTE: DİKKAT! İçinde solüsyon olmadan kanülü asla ısıtmayın, aksi takdirde geri dönüşü olmayan bir şekilde hasar görebilir. Ayarlanan değer ile ısıtma kanülünün ucundaki ve kayıt odası içindeki gerçek değer arasındaki içsel sıcaklık farkını hesaba katmak için kanülün sıcaklığını kayıt sıcaklığından (yani 32 - 34 °C) daha yükseğe ayarlayın. Kayıt odasının akış hızı, ortam sıcaklığı ve hacminin tümü kayıt çözümünün sıcaklığını etkiler. Adım 1.9'da bildirilen ayarlar, açıklanan protokol ve ekipman için optimize edilmiştir. Her zaman bir termokupl kullanarak gerçek kayıt sıcaklığını kontrol edin ve ayarları gerektiği gibi yapın. Beyin diliminin aşırı ısınmasını önlemek için MEA tabanını 34 °C'nin üzerinde ısıtmayın.
- Harici referans elektrodunu kayıt odası giriş haznesine yerleştirin.
not: MEA yongaları dahili bir referans elektrotu ile donatılmış olsa da, özel kayıt odası bunu kapsar. Bu nedenle, harici bir referans elektrodu kullanılmalıdır. Doymuş bir KCl (Potasyum klorür) peleti, klorlamaya ihtiyaç duymadan kullanıma hazır olduğu için en pratik olanıdır.
2. MEA Canlı Haritalama
- 4AP-ACSF seviyesi ve kayıt sıcaklığı istendiği gibi stabilize edildikten sonra, perfüzyonu ve emme musluklarını geçici olarak durdurmak için kapalı konuma getirin.
- Ters çevrilmiş bir cam Pasteur pipeti kullanarak bir beyin dilimini hızlı bir şekilde MEA kayıt odasına aktarın. Ateşle parlatılmış kıvrılmış bir Pasteur pipeti (Şekil 1C) veya yumuşak, kompakt bir fırça kullanarak MEA kayıt alanındaki konumunu gerektiği gibi ayarlayın. Tutma ankrajını (Şekil 1D) beyin dilimine yerleştirin. Musluklarını tekrar açık konuma getirerek perfüzyonu ve emişi yeniden başlatın.
NOTE: KRİTİK DEĞERLİ! Dilim transfer edilmeli ve perfüzyon 60 saniye içinde yeniden başlatılmalıdır, aksi takdirde doku ölebilir. Yüzeysel gerginlikteki farklılıklar nedeniyle ankraj beyin dilimi üzerine yerleştirilirken beyin diliminin hareket etmesini önlemek için dilim tutma ankrajı 4AP-ACSF'de tutulmalıdır. Beyin dilimini MEA'ya sabitlemek için kullanılan ankraj, paslanmaz çelik tel ve naylon iplik kullanılarak özel olarak üretilebilir (Şekil 1D) veya ticari kaynaklardan elde edilebilir. Şekil 1E, amplifikatörün kafasına bağlı MEA çipi ile yapılan son deney kurulumunu göstermektedir: kayıt odası içindeki MEA çipi üzerinde duran bir beyin dilimi, özel ankraj tarafından tutulur. Referans elektrot (kırmızı daire) ve ısıtma kanülünü kaplayan PTFE boru (kırmızı ok) giriş haznesine yerleştirilirken, emme iğnesi (mavi ok) çıkış haznesine yerleştirilmiştir.
- Ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine monte edilmiş bir kamera kullanarak beyin diliminin bir resmini çekin.
- Elektrotları eşlemek üzere GUI'yi başlatmak için bilgisayar yazılımında mapMEA komut dosyasını çalıştırın.
not: Özel yapım yazılım, kullanıcının beyin diliminin belirli yapılarına karşılık gelen elektrotları seçmesine olanak tanır. Bu adım, doğru yolu aktive etmek ve elektriksel stimülasyon kullanarak iktal aktiviteyi baskılamak için çok önemlidir.
- Beyin diliminin resmini yüklemek için Araştır düğmesine tıklayın. Referans elektrodunun MEA'nın sol yarım tarafının üst satırında göründüğünden emin olun (Şekil 2A, üçgen işareti). İşaretçiyi Etkinleştir düğmesini tıklayın, ardından görüntü düzleştirme ve elektrot eşleme için XY koordinatlarını işaretlemek üzere dizinin en sol satırındaki üst ve alt elektrotları seçin.
- Dilim türü açılır menüsünden Yatay'ı seçin. Varsayılan yapılar onay kutusunu işaretleyin.
not: Yeni Yapılara Gir düğmesini seçerek yapıları özelleştirmek mümkündür. Yatay beyin dilimi için varsayılan yapılar Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- Beyin dilimi resminin altındaki numaralı butonları kullanarak, ROI'ye karşılık gelen elektrotları seçin ve bunları atamak için yapılar panelindeki ilgili butona tıklayın (Şekil 2B); her ROI için bu adımı tekrarlayın.
- Kaydet düğmesine basın: yazılım, seçilen elektrotları ve ROI'leri bildiren bir tablo içeren #EXP_LabelledElectrodes adlı bir sonuç klasörü oluşturur.
3. Epileptiform Aktivitenin Kaydedilmesi ve Elektriksel Modülasyonu
- Kayıttan önce beyin diliminin kayıt odası içinde 5 - 10 dakika stabilize olmasına izin verin.
- Kendi kendine kalibrasyon ve stabilizasyona izin vermek için stimülasyon protokolünden en az 10 dakika önce uyaran ünitesini açın. Uyaran kontrol yazılımını başlatın ve uyarıcı ve MEA amplifikatörünün, uyaran kontrol yazılımının ana panelindeki yeşil bir LED ile gösterildiği gibi doğru şekilde bağlandığını doğrulayın.
- Stimülasyonu bipolar bir konfigürasyonda ayarlayın. CA1/proksimal subikulumun piramidal hücre tabakası ile temas halinde olan elektrot çiftlerini (cf.24,25) komut dosyası mapMEA ile eşlenenler arasından seçin (cf. bölüm 12). Seçilen elektrotlardan birini stimülatörün negatif fişine ve diğer elektrodu aynı stimülatör kanalının pozitif fişine bağlamak için bir tel kullanın. Stimülatörün topraklamasını amplifikatörün toprağına bağlamak için başka bir kablo kullanın.
- Kayıt yazılımını başlatın. Veri almak için, kayıt yazılımının ana panelindeki OYNAT düğmesine basın. En az 4 iktal deşarj kaydedin.
not: 2 kHz'lik bir örnekleme frekansı, sabit disk alanı kullanımını en aza indirirken adil çözünürlükle alan potansiyellerinin elde edilmesini sağlar. 5 dakikalık bir kayıt dosyası ~ 80 MB alır. Örneğin, uyaran artefaktlarını veya çok birimli aktiviteyi kaydetmek için daha yüksek örnekleme frekansları gerekebilir. Yalnızca alan potansiyellerini gözlemlemek için, çok birimli aktiviteyi kesmek için 300 Hz'de canlı bir alçak geçiren filtre kullanın.
- Uyaran yoğunluğunu belirleyin.
- Uyaran kontrol yazılımında, 100 μs/faz.
'lik kare bifazik pozitif-negatif akım darbe süresi tasarlamak için ana paneli kullanın
NOTE: DİKKAT! Doğru akım stimülasyonu, ekipmana zarar vermemek için dengeli bir şarj darbesi gerektirir.
- En iyi uyaran yoğunluğunu belirlemek için hızlı bir giriş/çıkış (G/Ç) testi yapın. Adım 3.5.1'de tasarlanan stimülasyon darbesini, uyaran kontrol yazılımının uygun biçiminde 0.2 s veya daha uzun bir darbeler arası aralık ekleyerek 5 Hz veya daha düşük bir hızda verin. Nabız genliği sekmesinde, 100 μA/fazlık bir başlangıç nabız genliği girin ve stimülasyon parahipokampal kortekslerde interiktal benzeri olayları güvenilir bir şekilde uyandırana kadar her denemede 50 - 100 μA'lık adımlarla artırın (kayıt yazılımı tarafından görselleştirilen sinyalleri kontrol edin).
- Limbik iktogenezin elektriksel modülasyonu
- İlgilenilen stimülasyon protokolünü sunmak için teşvik ünitesini programlayın. G/Ç testi sırasında tanımlanan uyaran genliğini kullanın.
not: Uyarılmış yanıtların başarısızlık oranı %≤20 olmalıdır.
- Stimülasyon durduktan sonra, en az 4 iktal deşarj kaydederek (adım 3.4'te olduğu gibi) ağın uyaran öncesi duruma geri döndüğünü doğrulayın.
