Mikroelektrot Dizileri Kullanılarak Beyin Dilimlerinde Nöbet ile İndüklenen Nöral Elektriksel Aktivitenin İzlenmesi

Özet

Kaynak: Panuccio, G., et al. Mikroelektrot dizilerine bağlı kemirgen beyin dilimlerinde epileptiform aktivitenin kaydedilmesi ve modülasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu protokol, nöbete neden olan bir ilaca maruz kalan bir beyin dilimindeki elektriksel aktiviteyi kaydetmek için bir mikroelektrot dizisi (MEA) kullanmayı içerir. Prosedür, beyin diliminin bir MEA kayıt odasına yerleştirilmesini, yapay nöbetleri indüklemek için elektriksel stimülasyon uygulanmasını ve elde edilen sinyallerin analiz edilmesini içerir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. MEA Kurulumunun Hazırlanması

Not: Kayıttan 15 dakika önce başlayın.

1. Kalan 4AP-ACSF (4-aminopiridin yapay beyin omurilik sıvısı) hacmini 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın.
2. Erlenmeyer şişesini MEA (Mikroelektrot dizileri) amplifikatörünün üzerindeki bir rafa yerleştirin ve çözeltinin sürekli olarak 60 mL'lik bir şırıngayı beslemesine izin vermek için boru kullanın. Erlenmeyer şişesinin ve şırınganın yüksekliğini 1 mL/dk.
   yerçekimi beslemeli bir hıza izin verecek şekilde ayarlayın not: Doğru yükseklik, boru iç çapına (ID) bağlıdır. 5/32 inç iç çaptaki borular için 30 cm yeterlidir.
3. 4AP-ACSF'yi Erlenmeyer şişesinde ve şırıngada %95 O₂/5% CO₂ gaz karışımı ile köpürtmeye başlayın.
4. 4AP-ACSF'nin perfüzyon tüpünden içinde hava kalmayana kadar bir behere akmasına izin verin; sonra çözelti akışını durdurun.
5. MEA tabanındaki ısıtma elemanını termostata bağlayın. Kuru MEA çipini MEA'nın içine yerleştirin amplifier ve amplifikatör kafasını sabitleyin. Plastik bir Pasteur pipeti, 4AP-ACSF'yi kayıt odasının girişine ve dış rezervuarına aktarır.
6. Isıtma kanülünü manyetik bir tutucuya sabitleyin ve ucunu kayıt odası giriş portunun içine yerleştirin. Manyetik tutucuyu MEA üzerindeki manyetik bir şeride takın. Perfüzyon tüpünü kanüle bağlayın. Kanülü termostata bağlayın.
   not: Isıtma kanülü, kayıt odası giriş portuna ulaşmak ve metalik malzemesi nedeniyle gürültüyü en aza indirmek için eğimli politetrafloroetilen (PTFE) boru ile kapatılmalıdır. Giriş rezervuarı 4AP-ACSF ile yeterince doldurulduğunda, perfüzyon sisteminden düşen damlalar görünmemelidir.
7. Emme iğnesini rezervuarın içine yerleştirin ve ACSF'ye daldırarak negatif basınç olduğunu doğrulayın; sabit bir düşük frekanslı emme gürültüsü olup olmadığını kontrol edin.
   not: Emme iğnesi, 4AP-ACSF beyin dilimi yüzeyinin hemen üzerine akacak şekilde yerleştirilmelidir. Bir vakum hattı veya düşük gürültülü bir vakum pompası kullanılabilir.
8. Akış regülatörünü 1 mL/dk'lık bir akış hızına izin verecek şekilde ayarlayın ve perfüzlemeye başlayın.
   not: Yerçekimi beslemeli perfüzyon, peristaltik pompaların neden olabileceği gürültüyü ortadan kaldırır; Peristaltik pompalar tercih edilirse, düşük gürültülü modeller zorunludur.
9. 4AP-ACSF kanülden akmaya başladığında termostatı açın. Kayıt odası içinde 32 - 34 °C'lik bir sıcaklık elde etmek için ısıtma kanülünü 37 °C'ye ve MEA tabanını 32 °C'ye ayarlayın.
   NOTE: DİKKAT! İçinde solüsyon olmadan kanülü asla ısıtmayın, aksi takdirde geri dönüşü olmayan bir şekilde hasar görebilir. Ayarlanan değer ile ısıtma kanülünün ucundaki ve kayıt odası içindeki gerçek değer arasındaki içsel sıcaklık farkını hesaba katmak için kanülün sıcaklığını kayıt sıcaklığından (yani 32 - 34 °C) daha yükseğe ayarlayın. Kayıt odasının akış hızı, ortam sıcaklığı ve hacminin tümü kayıt çözümünün sıcaklığını etkiler. Adım 1.9'da bildirilen ayarlar, açıklanan protokol ve ekipman için optimize edilmiştir. Her zaman bir termokupl kullanarak gerçek kayıt sıcaklığını kontrol edin ve ayarları gerektiği gibi yapın. Beyin diliminin aşırı ısınmasını önlemek için MEA tabanını 34 °C'nin üzerinde ısıtmayın.
10. Harici referans elektrodunu kayıt odası giriş haznesine yerleştirin.
    not: MEA yongaları dahili bir referans elektrotu ile donatılmış olsa da, özel kayıt odası bunu kapsar. Bu nedenle, harici bir referans elektrodu kullanılmalıdır. Doymuş bir KCl (Potasyum klorür) peleti, klorlamaya ihtiyaç duymadan kullanıma hazır olduğu için en pratik olanıdır.

2. MEA Canlı Haritalama

1. 4AP-ACSF seviyesi ve kayıt sıcaklığı istendiği gibi stabilize edildikten sonra, perfüzyonu ve emme musluklarını geçici olarak durdurmak için kapalı konuma getirin.
   1. Ters çevrilmiş bir cam Pasteur pipeti kullanarak bir beyin dilimini hızlı bir şekilde MEA kayıt odasına aktarın. Ateşle parlatılmış kıvrılmış bir Pasteur pipeti (Şekil 1C) veya yumuşak, kompakt bir fırça kullanarak MEA kayıt alanındaki konumunu gerektiği gibi ayarlayın. Tutma ankrajını (Şekil 1D) beyin dilimine yerleştirin. Musluklarını tekrar açık konuma getirerek perfüzyonu ve emişi yeniden başlatın.
      NOTE: KRİTİK DEĞERLİ! Dilim transfer edilmeli ve perfüzyon 60 saniye içinde yeniden başlatılmalıdır, aksi takdirde doku ölebilir. Yüzeysel gerginlikteki farklılıklar nedeniyle ankraj beyin dilimi üzerine yerleştirilirken beyin diliminin hareket etmesini önlemek için dilim tutma ankrajı 4AP-ACSF'de tutulmalıdır. Beyin dilimini MEA'ya sabitlemek için kullanılan ankraj, paslanmaz çelik tel ve naylon iplik kullanılarak özel olarak üretilebilir (Şekil 1D) veya ticari kaynaklardan elde edilebilir. Şekil 1E, amplifikatörün kafasına bağlı MEA çipi ile yapılan son deney kurulumunu göstermektedir: kayıt odası içindeki MEA çipi üzerinde duran bir beyin dilimi, özel ankraj tarafından tutulur. Referans elektrot (kırmızı daire) ve ısıtma kanülünü kaplayan PTFE boru (kırmızı ok) giriş haznesine yerleştirilirken, emme iğnesi (mavi ok) çıkış haznesine yerleştirilmiştir.
2. Ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine monte edilmiş bir kamera kullanarak beyin diliminin bir resmini çekin.
3. Elektrotları eşlemek üzere GUI'yi başlatmak için bilgisayar yazılımında mapMEA komut dosyasını çalıştırın.
   not: Özel yapım yazılım, kullanıcının beyin diliminin belirli yapılarına karşılık gelen elektrotları seçmesine olanak tanır. Bu adım, doğru yolu aktive etmek ve elektriksel stimülasyon kullanarak iktal aktiviteyi baskılamak için çok önemlidir.
4. Beyin diliminin resmini yüklemek için Araştır düğmesine tıklayın. Referans elektrodunun MEA'nın sol yarım tarafının üst satırında göründüğünden emin olun (Şekil 2A, üçgen işareti). İşaretçiyi Etkinleştir düğmesini tıklayın, ardından görüntü düzleştirme ve elektrot eşleme için XY koordinatlarını işaretlemek üzere dizinin en sol satırındaki üst ve alt elektrotları seçin.
5. Dilim türü açılır menüsünden Yatay'ı seçin. Varsayılan yapılar onay kutusunu işaretleyin.
   not: Yeni Yapılara Gir düğmesini seçerek yapıları özelleştirmek mümkündür. Yatay beyin dilimi için varsayılan yapılar Şekil 2A'da gösterilmiştir.
6. Beyin dilimi resminin altındaki numaralı butonları kullanarak, ROI'ye karşılık gelen elektrotları seçin ve bunları atamak için yapılar panelindeki ilgili butona tıklayın (Şekil 2B); her ROI için bu adımı tekrarlayın.
7. Kaydet düğmesine basın: yazılım, seçilen elektrotları ve ROI'leri bildiren bir tablo içeren #EXP_LabelledElectrodes adlı bir sonuç klasörü oluşturur.

3. Epileptiform Aktivitenin Kaydedilmesi ve Elektriksel Modülasyonu

1. Kayıttan önce beyin diliminin kayıt odası içinde 5 - 10 dakika stabilize olmasına izin verin.
2. Kendi kendine kalibrasyon ve stabilizasyona izin vermek için stimülasyon protokolünden en az 10 dakika önce uyaran ünitesini açın. Uyaran kontrol yazılımını başlatın ve uyarıcı ve MEA amplifikatörünün, uyaran kontrol yazılımının ana panelindeki yeşil bir LED ile gösterildiği gibi doğru şekilde bağlandığını doğrulayın.
3. Stimülasyonu bipolar bir konfigürasyonda ayarlayın. CA1/proksimal subikulumun piramidal hücre tabakası ile temas halinde olan elektrot çiftlerini (cf.24,25) komut dosyası mapMEA ile eşlenenler arasından seçin (cf. bölüm 12). Seçilen elektrotlardan birini stimülatörün negatif fişine ve diğer elektrodu aynı stimülatör kanalının pozitif fişine bağlamak için bir tel kullanın. Stimülatörün topraklamasını amplifikatörün toprağına bağlamak için başka bir kablo kullanın.
4. Kayıt yazılımını başlatın. Veri almak için, kayıt yazılımının ana panelindeki OYNAT düğmesine basın. En az 4 iktal deşarj kaydedin.
   not: 2 kHz'lik bir örnekleme frekansı, sabit disk alanı kullanımını en aza indirirken adil çözünürlükle alan potansiyellerinin elde edilmesini sağlar. 5 dakikalık bir kayıt dosyası ~ 80 MB alır. Örneğin, uyaran artefaktlarını veya çok birimli aktiviteyi kaydetmek için daha yüksek örnekleme frekansları gerekebilir. Yalnızca alan potansiyellerini gözlemlemek için, çok birimli aktiviteyi kesmek için 300 Hz'de canlı bir alçak geçiren filtre kullanın.
5. Uyaran yoğunluğunu belirleyin.
   1. Uyaran kontrol yazılımında, 100 μs/faz.
      'lik kare bifazik pozitif-negatif akım darbe süresi tasarlamak için ana paneli kullanın NOTE: DİKKAT! Doğru akım stimülasyonu, ekipmana zarar vermemek için dengeli bir şarj darbesi gerektirir.
   2. En iyi uyaran yoğunluğunu belirlemek için hızlı bir giriş/çıkış (G/Ç) testi yapın. Adım 3.5.1'de tasarlanan stimülasyon darbesini, uyaran kontrol yazılımının uygun biçiminde 0.2 s veya daha uzun bir darbeler arası aralık ekleyerek 5 Hz veya daha düşük bir hızda verin. Nabız genliği sekmesinde, 100 μA/fazlık bir başlangıç nabız genliği girin ve stimülasyon parahipokampal kortekslerde interiktal benzeri olayları güvenilir bir şekilde uyandırana kadar her denemede 50 - 100 μA'lık adımlarla artırın (kayıt yazılımı tarafından görselleştirilen sinyalleri kontrol edin).
6. Limbik iktogenezin elektriksel modülasyonu
7. İlgilenilen stimülasyon protokolünü sunmak için teşvik ünitesini programlayın. G/Ç testi sırasında tanımlanan uyaran genliğini kullanın.
   not: Uyarılmış yanıtların başarısızlık oranı %≤20 olmalıdır.
8. Stimülasyon durduktan sonra, en az 4 iktal deşarj kaydederek (adım 3.4'te olduğu gibi) ağın uyaran öncesi duruma geri döndüğünü doğrulayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Bu protokol için kullanılan özel ekipman. (A) 4AP'de geri kazanım, ön ısıtma ve ön inkübasyon için tutma odaları, bir beher ve bir Petri kabı kullanılarak monte edilir. Petri kabının çapı kırıcıdan daha küçük olmalı ve bir şırınga pistonu vasıtasıyla yerinde tutulmalıdır. Petri kabının alt kısmı, Petri kabının kenarına siyanoakrilat ile yapıştırılmış bir naylon ağ (yumuşak çoraplardan) ile değiştirilir. Oksijen, Petri kabının duvarları ile beher arasına yerleştirilen bükülmüş bir omurga iğnesi (22 G) aracılığıyla sağlanır. Kabarcıklar beherin yanından çıkmalı ve beyin diliminin yer değiştirmesini önlemek için asla naylon ağa ulaşmamalıdır. Bir Petri kabının üst kısmı, ACSF buharlaşmasını önlemek ve oksijen doygunluğunu korumak için bir kapak olarak kullanılabilir. (B) Özel kayıt odası. İçinde: ısıtma kanülünü ve referans elektrodunu yerleştirmek için giriş haznesi. Çıkış: emme iğnesini yerleştirmek için çıkış haznesi. Kayıt: kayıt odası. (C) Dokuyu tutmak ve kayıt odası içindeki konumunu ayarlamak için ateşle parlatma ile kıvrılmış bir cam Pasteur pipeti kullanılır. (D) Özel dilim tutma ankrajı. (E) MEA çipine monte edilmiş kayıt odasının son montajı. Bir beyin dilimi, çapa tarafından yerinde tutulan altta durur. Kırmızı ok, ısıtma kanülünü kaplayan PTFE borusunu gösterirken, kırmızı daire, ACSF tarafından giriş rezervuarına batırılmış doymuş bir KCl peleti olan referans elektrodu gösterir. Mavi ok, çıkış haznesindeki emme iğnesini gösterir.

Şekil 2: Canlı MEA elektrot haritalaması için GUI.(A) MEA üzerinde konumlandırılmış birleşik hipokampus-EC diliminin şematik gösterimi. Bu protokol için kullanılan varsayılan yapılar cornu ammonis 3 (CA3), entorinal korteks (EC), perirhinal korteks (PC) ve subiculum'dur (SUB). Referans elektrot, bir üçgen işaretleyici olarak şematize edilmiştir. Noktalı çizgilerle çevrelenmiş elektrotlar, görüntü düzleştirme için XY koordinatlarını temsil eder. (B) Canlı MEA eşlemesi sırasında GUI'nin ekran görüntüsü. Yakalamanın solundaki akış şeması, izlenecek adım adım prosedürü gösterir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Poli-D-Lizin	Sigma-Adrich	P7886 Serisi	MEA kaplama için gereklidir
NaCl (Doğal)	Sigma-Adrich	S9888 Serisi	kimyasal
Kartal	Sigma-Adrich	P9541 Serisi	kimyasal
KH2PO4	Sigma-Adrich	795488	kimyasal
CaCl2*2 H2O	Sigma-Adrich	C3306	kimyasal
D-Glikoz	Sigma-Adrich	RDD016	kimyasal
NaHCO3	Sigma-Adrich	S5761 Serisi	kimyasal
MgCl2*6 H2O	Sigma-Adrich	M2670	kimyasal
MgSO4*6 H2O	Sigma-Adrich	M5921	kimyasal
Sakaroz	Sigma-Adrich	RDD023	kimyasal
Pirüvik Asit, %98	Sigma-Adrich	107360	kimyasal
4-aminopiridin	Sigma-Adrich	A78403	Konvülsan ilaç
STG-2004	Çok Kanallı Sistem	STG4004-1.6mA	Gerilim (±8 V) ve akım çıkışlı (±1,6 mA) 4 kanallı uyaran jeneratörü
MEA1060	Çok Kanallı Sistem	Yok	MEA amplifikatör
düzlemsel MEA	Çok Kanallı Sistem	60MEA500/30iR-Ti, yüzüksüz	Özel kayıt odasının kullanılmasına izin vermek için zil sesi olmamalıdır
McRack (Raf)	Çok Kanallı Sistem		Kayıt yazılımı
McStimulus II (Uyaran Yıldızı)	Çok Kanallı Sistem		STG4004 kontrol yazılımı
TC02	Çok Kanallı Sistem	TC02	2 kanallı termostat
PH01	Çok Kanallı Sistem	PH01	Isıtma perfüzyon kanülü
Mil	Çok Kanallı Sistem	Mil	PH01 ve emme iğnesi için manyetik tutucu
Elastostil E43	Wacker	E43	Özel kayıt odasını MEA'ya monte etmek için kullanılan elastomerik dolgu macunu
MEA Gümrük Odası	Krisel Enstrüman	SKE odası MEA	Özel kayıt odası
Ag/AgCl elektrot, pelet, 1.0 mm	Krisel Enstrüman	64-1309	Özel kayıt odası için referans elektrodu
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1 adet	Enzimatik temizleyici
MATLAB (MATEMAT)	Matematik Eserleri		Elektrodemapping için programlama ortamı
VT1000S	Leica Biyosistem	VT1000S	Vibratom
	Warner Enstrümanları	64-1309	Ag-AgCl Elektrot Peleti 1.0 mm (E205). Referans elektrodu.

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Tezli Yüksek Lisans Programı Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi