Koku Alma Duyu Nöronlarının Optogenetik Stimülasyonuna Yanıt Olarak Drosophila Larvalarının Seyir Davranışı

Özet

Kaynak: Clark, D. A., et al. Koku Alma Nöronlarının Optogenetik Stimülasyonuna Yanıt Olarak Drosophila Larva Davranışının İzlenmesi. (2018).

Bu video, koku alma duyu nöronlarının (ORN'ler) optogenetik uyarılmasına yanıt olarak Drosophila larvalarının navigasyon davranışı üzerine bir çalışmayı göstermektedir. ORN'lerde ışığa duyarlı iyon kanallarını eksprese eden transgenik Drosophila larvaları, bir davranış alanı içinde agaroz üzerine yerleştirilir. Işıkla optogenetik stimülasyon kanalları açarak sinyalin beyne iletimini tetikleyen bir katyon akışına neden olur ve navigasyon davranışı kaydedilir.

Protokol

1. Bir Davranış Alanı Oluşturmak ve Davranış Alanında Optogenetik Stimülasyonu Mümkün Kılmak İçin Donanım Hazırlamak

1. Işıktan yoksun bir davranış alanı oluşturmak için, siyah renkli pleksiglas akrilik levhalardan (3 mm kalınlığında) yapılmış 89 x 61 x 66 cm³ (35" U x 24" G x 26" Y) boyutunda bir kutu oluşturun (bkz. Böyle bir kutu oluşturmak için malzemeler yerel donanım mağazalarında bulunmalıdır. Bu kutuyu davranış odasındaki bir masa üstüne yerleştirin (Şekil 1A).
2. Kızılötesi (IR) uzun geçişli 830 nm filtre ve 8 mm F1.4 C yuvalı lens (Malzeme Tablosuna bakın) ile donatılmış tek renkli bir evrensel seri veri yolu (USB) 3.0 şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamerasını kara kutunun tavanının ortasına monte edin. Karanlık arenada larvaları aydınlatmak için masanın üzerine iki kızılötesi ışık yayan diyot (LED) şeridi (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin (Şekil 1A).
3. LED platformunu oluşturmak için 22 cm × 22 cm kare Alüminyum plaka elde edin (yansımaları ortadan kaldırmak için tercihen mat siyah bir kaplama ile sprey boyalı). Plakanın ortasında, metal bir kesici kullanarak CCD kameranın etrafına sığacak kadar büyük bir delik açın.
4. Metal plakayı kırmızı LED şerit ışıklarla örtün (Malzeme Tablosuna bakın). LED ışık şeridi kablolarını seri olarak lehimleyin ve şerit tellerini bir Raspberry Pi 2B mikroişlemci tarafından kontrol edilen bir optokuplör rölesine besleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1B ve 2).
5. Optokuplör rölesini LED şeritlere bağlamadan önce Raspberry Pi işlemciye Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux tabanlı işletim sistemini kurun ve yapılandırın. LED şeritlere ve optokuplöre güç sağlamak için bir güç kaynağı bağlayın (Şekil 2) (Malzeme Tablosuna bakın). LED platformunu CCD kameranın etrafına monte edin (Şekil 1B).
   not: Ubuntu Mate v16.04 işletim sistemi ücretsiz olarak kullanılabilir. Bir dizi basit Python tabanlı komut, LED ışık uyaranlarının program modellerine kolayca uyarlanabilir (sözdizimi dosyasına bakınız).
6. Davranış alanının çeşitli noktalarında homojen ışınım sağlayın. Bir Spektrometre yardımıyla arenanın yüzeyindeki mutlak ışınımı ölçün ve arenanın yüzeyi boyunca ~1.3 W/^m2 olarak belirleyin.
   not: Bu yoğunlukta, deneyler boyunca sıcaklıkta önemli bir değişiklik gözlenmedi. Başka bir çalışma, ~ 1.9 W /^m2'lik daha yüksek bir ışınım kullandı ve deneyler boyunca sıcaklıkta hiçbir değişiklik gözlemlemedi.

2. Drosophila Larvalarının Davranış Analizleri için Hazırlanması

1. Sinekleri standart sinek yemi üzerinde (Malzeme Tablosuna bakınız) 25 °C, %50-60 bağıl nem (RH) ve 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde tutun.
2. CsChrimson'u tek bir ORN çiftinde ifade etmek için, bakire dişileri bir UAS-IVS-CsChrimson hattından bir OrX-Gal4 hattından erkeklere çaprazlayın ('X', 21 larva koku reseptöründen birine karşılık gelir (Or) 21 ORN çiftinin her birinde benzersiz bir şekilde ifade edilen genler).
   1. Alternatif olarak, 21 larva ORN'nin tümünde CsChrimson'u eksprese etmek için, bakire dişileri bir UAS-IVS-CsChrimson hattından bir Orco-Gal4 hattından erkeklere çaprazlayın ('Orco', 21 ORN'nin tümünde ifade edilen ko-reseptördür).
   2. Bu deneylerde UAS-IVS-CsChrimson satırını tek başına bir kontrol olarak kullanın.
      not: Burada listelenen sinek stoklarının tümü Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nde mevcuttur (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Bir çaprazdaki erkek ve dişi sineklerin çiftleşmesine ve 48 saat boyunca yumurta bırakmasına izin verildikten sonra, yetişkinleri taze bir şişeye aktarın.
   1. Yumurta içeren gıda şişesinin yüzeyine, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözünmüş 400 μM all-trans retinal (ATR) ve damıtılmış suda çözülmüş 89 mM sükroz içeren bir karışımdan 400 μL ekleyin.
      not: Az miktarda sükroz, ATR çözeltisinin larva beslenmesini teşvik eder. ATR, CsChrimson ifadesinin yukarı regülasyonu için gerekli bir kofaktördür. ATR ışığa duyarlıdır.
   2. Yumurta içeren gıda şişelerine ATR eklendikten sonra, şişeleri karanlıkta 72 h.
      NOT: Bu çalışma ve yukarıdaki iki çalışma, ATR beslemesine bağlı larva davranışı üzerinde herhangi bir etki gözlemlememiş olsa da, ATR içermeyen yukarıdaki karışımın aynı miktarına test hatlarına tabi tutularak ATR beslemesinin etkilerinin kontrol edilmesi önerilir.
4. Üçüncü instar larvaları (yumurtlamadan ~ 120 saat sonra) yüksek yoğunluklu (% 15) bir sükroz çözeltisi kullanarak yüzdürerek sinek yeminin yüzeyinden çıkarın. Bir P1000 mikropipet kullanarak, sakaroz çözeltisinin yüzeyinde yüzen larvaları 1000 mL'lik bir cam behere ayırın.
5. Her seferinde cam beherde 800 mL taze damıtılmış su değiştirerek larvaları 3-4 kez yıkayın. Larvaları davranış testine tabi tutmadan önce 10 dakika dinlenmeye bırakın.

>3. Davranış Deneyi

1. Davranış odasında tutarlı sıcaklık (22–25 °C arasında) ve nem (%50 ila %60 RH arasında) koruyun.
2. 22 cm x 22 cm kare Petri kabına 150 mL eritilmiş agaroz (% 1.5) dökerek larva tarama ortamını hazırlayın. Testin her denemesi için bir Petri kabı dökülür, deney başına 8-10 deneme. Davranış tahlilinde kullanmadan önce agarozun Petri kaplarında 1-2 saat katılaşmasına ve soğumasına izin verin.​
   1. Hazırlanmış üçüncü instar larvalarının en fazla 20'sini Petri kabının merkezine aktarın (Şekil 1C). Petri kabını kapağıyla örtün. Petri kabını CCD kameranın altındaki davranış alanına yerleştirin.
      not: Deneye bağlı olarak, davranış testleri tipik olarak 3-5 dakika boyunca gerçekleştirilir. Tahlilde rehberlik ipuçları sağlamak için bir koku verici kullanılırsa, ortaya çıkan koku gradyanının yaklaşık 5 dakika boyunca stabil kaldığı gözlemlenmiştir. Daha uzun tahlil süreleri önerilmez. Dehidrasyon veya uzun süreli 630 nm kırmızı ışığa maruz kalma nedeniyle larvalar üzerinde zararlı etkiler bu zaman noktalarında gözlenmemiştir.
3. Videodaki larvaları görselleştirmek için 850 nm kızılötesi LED ışık kaynağını AÇIN. Larva hareketini kaydetmek için CCD kamerayı başlatın.
4. Raspberry Pi işlemcisiyle ilişkili yazılımı kullanarak, uygun kırmızı ışık stimülasyonu modellerini uygulamak için prosedürü programlayın.
   not: Bir dizi basit Python tabanlı komut, LED ışık uyaranlarının program modellerine kolayca uyarlanabilir (sözdizimi dosyasına bakınız).

Sonuçlar

Şekil 1: Davranış alanı ve larva tarama ortamı. (A) Kara kutu davranış alanının önden görünümü. Arenanın açık kapısı, kutunun tavanından sarkan bir CCD kamerayı ortaya çıkarıyor. (B) Optogenetik stimülasyonlar için kullanılan kırmızı LED ışık şeritlerini içeren metal bir platformun alttan görünümü, CCD kameranın etrafına monte edilmiştir. (C) Testte kullanılan larva t...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Larva hareketini yakalamak için video kamera
CCD Kamera	Edmund Optik	106215
M52 - M55 Filtre İpliği Adaptörü	Edmund Optik	59-446
Görüntüleme lensleri için 2" kare dişli filtre tutucu	Edmund Optik	59-445
RG-715, 2" Kare Uzun Geçiren Filtre	Edmund Optik	46-066
Optogenetik kurulum için elektronik
Ahududu Pi 2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
3 Kanal programlanabilir güç kaynağı	newegg.com	9SIA3C62037092
8 Kanal optokuplör rölesi	amazon.com	6454319
630nm Dört sıralı LED şerit ışıkları	environmentallights.com	KIRMIZI3528-450-Makara
850nm LED şeritler	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2 takımı
yazılım
Ubuntu MATE v16.04	Nubuntu	https://github.com/yslo/nubuntu
Diğer öğeler
Pleksiglas siyah akrilik	Ev Deposu	MC1184848bl
Yiyecek ve diğer reaktifleri uçurun
Nutrifly sinek yemi	Genesee Bilimsel	66-112
Agaroz tozu	Genesee Bilimsel	20-102
22cm X 22cm kare petri tabak	VWR A.Ş.	25382-327
DMSO (Türkçe)	Sigma-Aldrich	D2650
Sakaroz	Sigma-Aldrich	84097
Tüm trans-retinal	Sigma-Aldrich	R2500
Sinek
UAS-IVS-CsChrimson	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	55134
Orko-Gal4	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	26818
VEYA42A-Gal4	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	9970
VEYA7a-Gal4	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	23907

Belediyesi arası arası Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi