Fare Hipokampal Dilimlerinde Uyarıcı Postsinaptik Akımların MikroRNA Aracılı İnhibisyonu

Özet

Kaynak: Thalhammer, A., et al. Bozulmamış Nöronal Devrelerde Gen Yıkımının Presinaptik Fonksiyon Üzerindeki Etkilerini Karakterize Etmek için Optogenetiği Yapay mikroRNA'larla Birleştirme. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, fare hipokampal beyin dilimlerinde uyarıcı sinaptik akımların mikroRNA aracılı inhibisyonunu göstermektedir. CA3 nöronları, bir floresan raportörü eksprese etmek için bir yapıyı, ışıkla aktive olan bir membran kanalını ve voltaj kapılı kalsiyum kanallarının ekspresyonunu aşağı regüle eden bir mikroRNA'yı barındıran rekombinant bir viral vektör ile enfekte edildi. Bir kayıt odasına bir dilim yerleştirildikten ve bir CA1 nöronunu bir kayıt pipeti ile yamaladıktan sonra, ışıkla aktive olan kanalı uyarmak için ışık darbeleri kullanıldı, bu da bir iyon akışı ile sonuçlandı ve bir aksiyon potansiyeli oluşturdu. CA3 nöronlarında voltaj kapılı kalsiyum kanallarının olmaması, nörotransmitter salınımını inhibe eder ve sinaptik olarak bağlı CA1 nöronlarında uyarıcı postsinaptik akımların inhibisyonuna neden olur.

Protokol

1. Optogenetik ile Devrilmiş Nöronların Hedefli Stimülasyonu ile Sağlam Nöronal Devrelerde Presinaptik Proteinlerin Rolünün Değerlendirilmesi

>NOT: Aşağıdaki protokol, akut beyin dilimlerinde elektrofizyolojik kayıtlarla ilgili önceden deneyim ve elektrofizyolojik bir kuruluma erişim gerektirir.

1. Stereotaktik olarak mozaik serotip 1 ve 2 (rAAV1/2) ile rekombinant adeno ilişkili virüsü beyne enjekte edin. Fare veya sıçan beyni için stereotaktik atlasları kullanarak ilgilenilen beyin bölgesi için stereotaktik koordinatları belirleyin.
   1. Ø 7–9 μm uzunluğunda sapları olan enjeksiyon mikropipetlerini çekmek için bir mikropipet çektirmesi kullanın; enjeksiyon mikropipetlerini saplara makasla klipsleyin. Enjeksiyon mikropipetlerine her 2 mm'de bir kalibrasyon işaretleri yerleştirmek için ince bir işaretleyici ve grafik kağıdı kullanın.
   2. Hayvanı izofluran ile uyuşturun ve stereotaktik aparata sabitleyin.
   3. 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı ile hayvanı çalışma boyunca sıcak tutun.
   4. Gözleri oküler kayganlaştırıcı ile koruyun.
   5. Kafadaki kürkü elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin.
   6. Bir pamuklu çubuk kullanarak traşlı kafaya povidon iyot yayın.
   7. Diseksiyon mikroskobu altında, orta hat insizyonu yapın.
   8. Bregma ve lambdayı görünür hale getirmek için kafatası yüzeyini bir pamuklu çubukla temizleyin.
   9. Enjeksiyon mikropipetini tutucusuna yerleştirin. Tutucuyu stereotaktik kola takın.
   10. Bregma ve/veya lambdaya göre enjeksiyon bölgesinin x ve y koordinatlarını belirleyin.
   11. Kafatasını hedef alan üzerinde inceltmek için bir matkap kullanın.
       not: Nazik dairesel hareketler kullanın ve beynin yüzeyine zarar vereceği için kafatasını delmekten kaçının.
   12. Kanama varsa, fazla kanı havlu kağıt ile emdirin.
       not: Aşırı kan, z koordinatının doğru bir şekilde belirlenmesini zorlaştıracaktır.
   13. Kılcal hareket ile enjeksiyon mikropipetine ≤2 μL virüs yükleyin.
   14. Enjeksiyon mikropipetini enjeksiyon bölgesinin x ve y koordinatlarına getirin.
   15. Duradan z koordinatını hesaplayın ve pipeti yavaşça beyne indirin.
   16. Z koordinatına ulaşıldığında, doku ayarlamasına izin vermek için 3 dakika bekleyin.
   17. Enjeksiyon mikropipetinin arkasına esnek bir tüp ile bağlanan 1 mL'lik bir şırınga kullanarak düşük pozitif basınç uygulayın. Diseksiyon mikroskobu aracılığıyla ve kalibrasyon işaretlerini referans noktaları olarak kullanarak virüsün enjeksiyon mikropipetinden fırlatma hızını görsel olarak izleyin.
       not: Doku hasarını önlemek için virüsün yavaş hızda (<100 nL / dak) enjekte edilmesi gerekir.
   18. Enjeksiyon bittiğinde, 5 dakika bekleyin, enjeksiyon mikropipetini 0,2 mm geri çekin, virüsün geri akışını önlemek için 5 dakika daha bekleyin.
   19. Enjeksiyon mikropipetini beyinden yavaşça ve tamamen çekin ve çamaşır suyu ile dolu bir kaba atın.
   20. Kafatasını fizyolojik solüsyonla ıslatın ve cildi 3-4 dikişle dikin.
   21. Yaraya gentamisin merhem sürün.
   22. Hayvanı, yiyecek peletleri olan temiz bir kafeste ve tamamen iyileşene kadar bir ısı lambası altında tek başına barındırın.
2. ≥Enjeksiyondan 15 gün sonra, derin izofluran anestezisi altında hayvanları dekapitasyon yapın.
3. 123 NaCl, 1.25 KCl, 1.25 KH 2 PO₄, 1.5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 sodyum piruvat ve 18 glikoz (ozmolarite 300 mOsm'ye ayarlanmış) içeren gazlı (% 95 O₂,% 5 CO₂) buz gibi yapay beyin omurilik Sıvısı (aCSF) çözeltisi kullanarak bir vibratom ile ilgilenilen beyin bölgesinin akut beyin dilimlerini hazırlayın. Örneğin, amaç CA3'ten CA1 piramidal nöronlara sinaptik iletimi analiz etmekse, hipokampal oluşumun (350 μm kalınlığında) sagital dilimlerini hazırlayın.
   not: Bu adımdan itibaren, optogenetik probun çevresel ışıkla aktivasyonunu önlemek için düşük ışık koşullarında çalışın.
4. Dilimlerin, beyin dilimlerini tutmak için tasarlanmış bir odada aynı aCSF'de 37 °C'de 30 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. Dilimleri kayıt yapana kadar oda sıcaklığında aynı beyin dilimi odasında tutun.
   not: Bu koşulları kullanarak, dilimler 6-8 saate kadar sağlıklı tutulabilir.
5. Bir dilimi suya batırılmış bir kayıt odasına aktarın ve 1,5 mM CaCl₂ (toplam Ca²⁺: 2,5 mM) ile desteklenmiş ve sodyum piruvat içermeyen geri kazanım için kullanılan aynı aCSF'den 2 mL/dk ile süperfüze edin.
   not: Dilimler, toksisiteyi en aza indirmek için düşük Ca²⁺ (1 mM) konsantrasyonunda hazırlanır ve muhafaza edilir. Kayıtlar, vezikül salınımını desteklemek için 2,5 mM Ca²⁺ olarak gerçekleştirilir.
6. İfade edilen floresan raportörün sinyalini kısaca kontrol edin (örn. TdTomato; Şekil 1B) enfeksiyonun lokalizasyonunu ve yoğunluğunu belirlemek için.
7. Bir yama elektrodunu (mM cinsinden) içeren hücre içi bir çözelti ile doldurun: 110 K-glukonat, 22 KCl, 5 NaCl, 0.5 etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N', tetraasetik asit (EGTA), 3 MgCl₂, 4 adenosin 5'-trifosfat magnezyum tuzu (Mg-ATP), 0.5 Guanozin 5'-trifosfat trisodyum tuzu (_Na3-GTP), 20 K₂-kreatin fosfat, 10 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit tamponu KOH ile ayarlanmış (HEPES-KOH, PH 7.28, 290 mΩ).
   not: 5–6 mΩ pipet direncine sahip yama elektrodu kullanın.
8. Kızılötesi aydınlatma altında, enfekte nöronlardan sinaptik girdiler alan bir nörondan sıkı sızdırmaz tüm hücre konfigürasyonuna ulaşın. Örneğin, CA3 piramidal nöronları enfekte olmuşsa, CA1 bölgesinin proksimal ila medial yolundaki piramidal nöronları yamalayın (Şekil 1C).
   not: Seri direnç telafi edilmeden bırakılabilir, ancak sabit ve düşük olmalıdır (≤20 MΩ).
9. İncelenen sinaptik akımları izole etmek için farmakolojiyi kullanın. Örneğin, amaç uyarıcı sinaptik iletimi araştırmaksa, 10 μM bikükülin ile inhibitör sinaptik iletimi bloke edin.
10. Sinaptik akımları, örneğin, uyarıcı postsinaptik akımları (EPSC'ler), enfekte nöronların somata üzerine yerleştirilmiş bir optik fibere (Ø ≤250 μm) bağlı 473 nm mavi lazer kullanarak uyandırın (örn. CA3 piramidal nöronlar).
    1. Işık darbesi başına birden fazla aksiyon potansiyeli uyandırma olasılığını azaltmak için stimülasyon uzunluğunu minimuma ayarlayın. ChETA kullanıyorsanız, 2 ms'ye ayarlayın.
    2. Lazerin stimülasyon gücünü, küçük ama açıkça tespit edilebilir sinaptik akımlar (CA3 ve CA1 piramidal nöronlar arasında -70 mV'luk bir tutma potansiyelinde kaydedilen EPSC'ler için ≤50 pA tepe genliği; Şekil 1D). ChETA ve 250 μm çapında bir optik fiber kullanılıyorsa, fiber çıkışında 1-3 mW'lık stimülasyon kuvvetleri uygun olmalıdır.
       NOT: lazer gücü düzenlenemiyorsa, nötr yoğunluk filtreleri kullanın.
    3. 473 nm lazer ışığını enfekte nöronların somalarına tutun, ancak aksonlarına değil. Örneğin, aksonların doğrudan depolarizasyonunu önlemek için ışığı CA3 somata'ya ve Schaffer teminatlarından uzağa tutun.
    4. Sodyum kanallarının bir blokeri olan tetrodotoksin (TTX; 0.5 μM), kanalların aksiyon potansiyeli tahrikli olduğunu doğrulamak için numuneye uygulayın.
    5. Farklı kayıtlarda, stimülasyonun seçici olduğunu doğrulamak için incelenen sinaptik akıma seçici bir engelleyici uygulayın.
       not: Örneğin, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) tipine 2,3-diokso-6-nitro-7-sülfamoil-benzo[f] kinoksalin (NBQX, 10 μM) uygulayın.
    6. Tekrarlayan stimülasyona yanıt olarak aynı akut beyin dilimindeki optik ve elektriksel olarak uyarılmış sinaptik akımları karşılaştırın (≤20 Hz'de ≥2 uyaran). Bir kontrol mikroRNA'sı (miR) kullanılırken elektriksel ve optik stimülasyon arasında benzer derecede sinaptik kolaylaştırma veya depresyon gözlenmelidir, bu nedenle benzer hücresel mekanizmaların iki tür stimülasyon tarafından aktive edildiğini düşündürür.
       not: Yukarıdaki adımlar, optik stimülasyonun presinaptik butonların doğrudan depolarizasyonunu indüklememesini ve böylece bazı sinaptik iletim mekanizmalarını atlamasını sağlamak için gereklidir.

Sonuçlar

Şekil 1. Optogenetik ile devrilmiş nöronların hedefli stimülasyonu ile doğal hipokampusta Ca_v2.1 [EFa] ve Ca_v2.1 [EFb] rolünün değerlendirilmesi. (A) İn vivo enfeksiyon için kullanılan rAAV yapılarının ifade kasetinin şeması. (B) TdTomato floresansının CA3 bölgesi ve projeksiyonları ile sınırlı olduğunu gösteren hipokampal bölüm.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Beyin dilimleri Ön Oda	Harvard Aygıtı	BSC-PC
CCD kamera tabanlı görüntüleyici	Biyo-Rad	ChemiDoc™ Milletvekili
Hücre Kültürü reaktifleri	Yaşam Teknolojileri
alıştırma	Önlük	K.1030
EGTA (EGTA)	Sigma	E4378
Gentamisin merhem	Yerel eczane
glikoz	Sigma	G7021
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	54459
Enjeksiyon mikropipetleri	Narishige (Narishig)	GD1
İnorganik tuzlar ve deterjanlar	Sigma
K2-kreatin fosfat	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	237911
KGluconate	Fluka Çiçeği	60245
lazer	Laserglow Teknolojileri	LRS-0473-GFM-00100-03
zar	Amersham	Protran™ 0.2 μm NC
MgATP (MgATP)	Sigma	A9187
Mikropipet tutucu	Narishige (Narishig)	IM-H1
Mikropipet çektirme	Narishige (Narishig)	PC-100
Na3GTP	Sigma	G8877
NaPiruvat	Sigma	P5280 Serisi
Oküler kayganlaştırıcı	Yerel eczane	Gözyaşı
Povidon iyot	Yerel eczane	Betadin
Stereotaktik aparat	TEFE
Tetrodotoksin	Tocris (Türkçe)	1069	zehirli
Vibratom	Leica Belediyesi	VT1200S