$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Kalsiyum Boya Yüklemesi
- Bireysel araştırmacının tercihine göre kalsiyum boyaları seçin. Burada Fluo-8AM veya Fluo-4AM kullanıyoruz. Bununla birlikte, bu yöntem diğer boyalara da uygulanabilir: DMSO'daki kalsiyum boyaları 1 mM'lik bir çözeltiye ve% 1 blok kopolimerlere (örneğin, pluronik asit-127) 50 μL'lik bir nihai hacme çözün ve 10 dakika boyunca sonikat yapın.
- Beyin dilimleri için 10 μM,% 0.01 blok kopolimerler nihai konsantrasyonuna kadar aCSF'ye çözelti ekleyin.
- Yetişkin hayvanlar için (>12 hafta), boyaları (50 μL) doğrudan beyin dilimlerine pipetleyin ve boyanın derin katmanlara daha iyi nüfuz etmesini sağlamak için 75 dakika bekletin.
- Boya inkübasyonu sırasında batık dilimin yeterli oksijenlenmesini sağlamak için, 2,5 mL aCSF ile seyreltilmiş kalsiyum boyaları ile kapalı bir kapaklı (2,5 cm çapında, 3,5 cm yüksekliğinde dairesel kavanoz) bir cam yükleme odası hazırlayın. % 95 O%2/5% CO2 ile sürekli oksijenlendirin. Kabarcık yapmayın.
- Boya yüklemesini takiben, dokuyu aCSF ile yıkayın ve deneysel kullanıma hazır olana kadar sıcaklığı yavaşça 15 - 16 ° C'ye düşerek inkübasyon sistemine aktarın.
2. Elektrofizyolojik Kayıtlar ve Görüntüleme
- Dokuyu mikroskop altında batık bir kayıt odasına yerleştirin ve RT (~22 °C) veya fizyolojik sıcaklıkta (~35 °C) 4 - 5 mL/dk akış hızında oksijenli aCSF ile perfüze edin. U şeklinde bir altın veya platin tel parçası üzerine gerilmiş ve yapıştırılmış naylon veya altın ipliklerden yapılmış özel yapım bir "arp" kullanarak dokuyu yerinde tutun.
- Elektrofizyoloji için:
- 5-6 MΩ'luk bir nihai direnç elde etmek için bir mikropipet çektirme kullanarak 1,5 mm (1,19 mm ID) borosilikat camdan kayıt pipetleri hazırlayın.
- Pipeti 3 - 4 μL dahili solüsyonla doldurun ve bir CCD kamera kullanarak hücreleri kızılötesi Diferansiyel Girişim Kontrastı (IR-DIC) altında görselleştirin. Hücre içi çözelti, deneysel sonuçlar elde etmek için her deneye dikkatlice uyarlanmalıdır.
- Bir mikromanipülatör kullanarak bir hücrenin zarı üzerindeki pipet tutucusundaki bir emme portundan uygulanan pozitif basıncı koruyarak pipeti konumlandırın. İLM retinadan çıkarıldığı için önceden membran kazıma işlemine gerek yoktur. Pipet hücrenin üzerine geldiğinde, gigaohm'luk bir sızdırmazlık elde etmek için pipete hafif bir negatif basınç uygulayın. Ardından, hücre zarını kısa bir miktar negatif basınçla yırtın.
- Uygun şekilde standart teknikleri kullanarak tüm hücre akım veya voltaj kelepçesi kayıtları yapın.
- Kalsiyum görüntüleme:
- Fluo-4'ün tek bir uyarma dalga boyu için, uyarma ışığını 460 - 490 nm bant geçiren bir filtreden ve yayılan ışığı 515 - 550 nm bant geçiren bir filtreden filtreleyin. En hızlı ve en hassas kayıt için yüksek hızlı bir dijital kamera kullanın. Görüntüleri gerektiği gibi alın.
- Floresandaki değişiklikleri tek bir dalga boyunda (Fluo-4) zamanın bir fonksiyonu olarak ölçün.