Tetrodotoksin ve Tetrodotoksine Dirençli Sodyum Kanalları Kullanılarak Monosinaptik Bağlantıların Test Edilmesi

Özet

Kaynak: Zhang, X. ve diğerleri, Tetrodotoksine Dirençli Sodyum Kanalları Kullanılarak Drosophila'da Monosinaptik Bağlantıların İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, transgenik bir sinek kullanarak monosinaptik bağlantıların test edilmesini gösterir. Sineğin presinaptik nöronlarında tetrodotoksine dirençli sodyum kanalları ve kırmızı ışıkla aktive olan kanallar bulunur ve bunlar postsinaptik nöronlara sinyalleri iletmek için optogenetik olarak uyarılır.

Protokol

1. Sinekleri Hazırlayın ve GAL4 Destekleyici Çizgileri Tanımlayın

1. Bir GAL4 promotör çizgisi seçin ve aktivasyon için hem UAS-NaChBac transgenini hem de optogenetik transgeni taşıyan sineklerle çaprazlayın.
   not: UAS-CsChrimson, yüksek iletkenliği ve tetrodotoksin (TTX) dirençli sodyum kanalı (NaChBac) aracılı aksiyon potansiyellerini aktive etme kolaylığı nedeniyle seçilmiştir. Hem UAS-NaChBac hem de UAS-CsChrimson, Bloomington Hisse Senetleri Deposundan edinilebilir.
2. All-trans retinal'i etanolde (35 mM) stok çözelti olarak hazırlayın ve çözeltiyi -20 ° C'de dondurucuda saklayın.
3. Bu stoğun 28 μL'sini yaklaşık 5 mL rehidre patates gevreği mamasına karıştırın ve bu karışımı geleneksel Drosophila ortamının bir şişesinin üstüne ekleyin.
4. 1-3 gün boyunca 0.2 mM all-trans-retinal içeren yiyeceklerde csChrimson eksprese eden yetişkin sinekleri yükseltin.

2. TTX Stoğunu Hazırlayın

1. Damıtılmış veya deiyonize suda 1 mM TTX'lik bir stok çözeltisi oluşturun. Bu çözeltiyi birkaç ay boyunca bir laboratuvar buzdolabında saklayın. Birçok kurum TTX'i tehlikeli veya kontrollü bir madde olarak sınıflandırdığından, kurumun TTX'in depolanmasına ilişkin politikalarını kontrol edin.

3. Sinekleri Elektrofizyolojiye Hazırlayın

1. All-trans-retinal ile yiyecek üzerinde yetiştirilen 1-3 günlük yetişkin sinekleri toplayın.
2. Sinekleri bir cam parıldama şişesine koyun. Sinekleri hareketsiz hale getirmek için şişeyi 1 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
3. Özel yapım bir kayıt odasına bir sinek sokmak için kaba forseps kullanın. Hazne, 1/16" akrilikten kesilmiş 3 1/2" daire lazerden oluşur. 2 parçalı epoksi ile özel bir folyonun tutturulduğu merkeze 3/4 inçlik bir delik açın. Folyo, sineğin içine sokulduğu üçgen şeklinde bir umut içerir.
4. Kayıt haznesine sıkıca sabitlemek için hayvanın etrafına balmumu veya ultraviyole (UV) ile kürlenebilen epoksi uygulayın.
5. Preparatı stereomikroskop altında görselleştirmek için bir deveboynu optik fiber ile aydınlatın. Deveboynu liflerini, sineği doğrudan yandan aydınlatacak şekilde ayarlayarak eğik aydınlatma için ayarlayın.
6. Işık seviyesini, sineğin net bir şekilde görüntülenmesine izin veren mümkün olan en düşük ayara ayarlayın. Bu ışık yoğunluğu bireysel deneylere göre değişecektir.
   not: Bu protokol, in situ beyin eksplant yöntemi kullanılarak uyarlanabilir.
7. Harici kayıt salinini alın. Salin mM cinsinden şunları içerir: 103 sodyum klorür, NaCl, 3 potasyum klorür, KCl, 5 N-tris (hidroksimetil) metil-2-aminoetan-sülfonik asit, 8 trehaloz, 10 glikoz, 26 sodyum bikarbonat, NaHCO₃, 1 sodyum dihidrojen fosfat, NaH₂PO₄, 1.5 kalsiyum klorür, CaCl₂ ve 4 magnezyum klorür, MgCl₂ (270-275 mΩ'a ayarlanmış). Tuzlu su %95 O₂/5 CO₂ (karbojen) ile köpürtülür ve 7.3'e ayarlanmış bir pH'a sahiptir.
8. Sinek preparatının üzerine 4-6 damla hücre dışı kayıt salini yerleştirin. Bu noktada, daha iyi görünürlük için diseksiyon mikroskobundaki ışık seviyesini artırın.
9. Elektroliz kullanarak bir tungsten telini keskinleştirin. Teli yapmak için, doymuş bir potasyum nitrat çözeltisi, KNO₃ hazırlayın ve telin ucunu uç keskinleşene kadar her biri 100 ms boyunca 20 kez çözeltiye daldırırken yaklaşık 20 V alternatif akım (AC) uygulayın. Sinek başındaki kütikülü çıkarmak ve böylece beyni açığa çıkarmak için keskinleştirilmiş tungsten teli kullanın.
10. Beyni, onu çevreleyen trakea ve yağ cisimciklerini çıkararak daha da açığa çıkarın. Anten loblarına erişiyorsanız, görünürlüğü artırmak için anteni folyo kayıt odasının altına nazikçe sıkıştırmak için bükülmüş bir tungsten tel veya benzeri bir alet kullanın. Kayıtların yapılacağı ilgi alanını kaplayan glial kılıfı nazikçe yırtmak için keskin forseps kullanın.
11. Kayıt odasını elektrofizyoloji donanımına aktarın. Beyni korumak için hemen karbojen ile köpürtülmüş harici kayıt salin ile perfüzyona başlayın. Tuzlu çözelti rezervuarı, mikroskop aşamasının üzerine yerleştirilir ve preparasyona yerçekimi ile beslenir. Atık tuzlu suyu toplamak için bir vakum hattı ve 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi kullanın.

4. Tam Hücre Kaydı Alın

1. Yama pipetlerini ticari bir pipet çektirme üzerine çekin. 7 mΩ'a yakın bir uç direncine sahip uygun bir pipet elde etmek için ayarlar için kılavuza bakın.
2. Bir yama pipetine 4 μL dahili kayıt solüsyonu ekleyin. İç salin, 140 potasyum aspartat, 10 N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES), 4 magnezyum adenosin trifosfat (MgATP), 0.5 Guanozin 5'-trifosfat trisodyum tuzu hidrat (_Na3GTP), 1 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve mM cinsinden 1 potasyum klorür (KCl) içerir.
3. Tam hücre kaydı için yama kelepçesi amplifikatörünü ayarlayın. Amplifikatörün ofsetini sıfırlayın ve amplifikatörü test darbeleri verecek şekilde ayarlayın. Burada, bir sistemleri Yama kelepçesi amplifikatörü 2,400 kullanılır.
4. Pipetten pozitif basınç uygulayın ve hücreye yaklaşın. Pipeti yönlendirmek ve hücreyle temas etmek için bir mikromanipülatör kullanın. Pozitif basıncı serbest bırakın. Membranın tutma potansiyelini -60 mV'a ayarlayın. Pipet, düşük bir alt pikoamp tutma akımı ile kanıtlandığı gibi, hücre zarı ile bir gigaohm contası oluşturmalıdır.
   not: Yeşil floresan protein (GFP) güdümlü hücre hedeflemesi kullanıyorsanız, ChR2 aktivasyonunu ve potansiyel sinaptik depresyonu önlemek için epifloresan ışık kullanımını en aza indirmeye çalışın. Ayrıca 5. adımı uygulamadan önce birkaç dakika bekleyin.
5. Amplifikatörü -50 mV ile -60 mV arasında test darbeleri verecek şekilde ayarlayın. Bu ayar, yama kelepçeli amplifikatörlerde standarttır. Test darbeleri, yama pipetini şarj etmek için gerekli akımı temsil eden büyük bir kapasitif geçici durum ortaya çıkaracaktır. 2400 veya benzeri bir amplifikatör üzerindeki kapasite dengeleme düğmelerini ayarlayarak kapasitif geçici akımları çıkarın.
6. Hücre zarını yırtmak ve tüm hücre konfigürasyonunu elde etmek için kısa negatif basınç darbeleri uygulayın.
   not: Nöronun kapasitansını gösteren kapasitif geçici olaylarda büyük bir artış olduğunda tam bir hücre konfigürasyonu gözlenir. Tutma akımında (referans değer) küçük bir artış da muhtemelen gözlemlenecektir. Amplifikatörü akım kelepçesi moduna ayarlayın ve hücrenin potansiyelini -50 ila -60 mV arasında ayarlayın.

5. Sinaptik Bağlantıyı Test Edin

1. Veri toplama (DAQ) sistemini, ışık darbeleri oluşturmak için bir ışık yayan diyot (LED) sürücüsünü tetikleyecek şekilde yapılandırın. Burada, bir LED sürücüsüne analog bir sinyal iletmek için Matlab ile birlikte bir National Instruments DAQ sistemi kullanılır. LED yoğunluğu, sürücüye giden analog sinyal aracılığıyla ayarlanır. LED, 620-630 nm dalga boyunda bir LED'dir.
2. Yüksek güçlü kırmızı LED'i hazırlığın hemen altına yerleştirin. Işık yoğunluğunu, 0,238 mW/^mm2 sineğe ulaşacak şekilde ayarlayın.
3. İlgilenilen postsinaptik hücreden kayıt yaparken presinaptik nöronları aktive edin. Optogenetik, farmakojenik olarak veya sinir stimülasyonu yoluyla hücre aktivasyonu elde edin. Burada, csChrimson ve kısa kırmızı ışık darbeleri uygulanır.
   NOT: Sinaptik bağlantılar, uyarıcı postsinaptik potansiyeller (EPSP'ler) olarak akım kelepçesinde veya uyarıcı postsinaptik akımlar (EPSC'ler) olarak voltaj kelepçesinde izlenebilir. 40 ms'lik bir ışık darbesine yanıt olarak TTX uygulanmadan önce sinaptik bir bağlantı görünmelidir. Herhangi bir bağlantı gözlenmezse, nöronların sinaptik olarak mono veya polisinaptik olarak bağlanması olası değildir. Tutma potansiyeli, buna göre uyarıcı veya inhibitör bağlantıları vurgulamak için ayarlanabilir.
4. Normal salinde bir bağlantı gözlenirse, 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için perfüzyon sistemine TTX ekleyin. TTX'i korumak için salini yakalamak ve yeniden kullanmak için bir devridaim pompası kullanın. Peristaltik pompa, tuzlu su çözeltisini banyodan çekecek ve tuzlu su rezervuarına geri döndürecektir.
5. Banyodaki tuzlu su seviyesinin yükselmesine ve düşmesine izin vermeyen güçlü ve sabit bir vakum sağlamak için pompanın hızını ayarlayın.
   not: TTX uygulaması, tüm hücrede izlenen nörondaki ani aktivitenin durmasına neden olmalıdır. Bu, tuzlu suya yeterli miktarda TTX eklendiğini doğrular.
6. Tekrar kısa kırmızı ışık darbeleri (her darbe için 40 ms) uygulayın. Bu noktada, kalan herhangi bir sinaptik bağlantı muhtemelen monosinaptiktir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
UAS-csChrimson	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	55135	Nöral aktivatör olarak kullanılır
UAS-NaChBac	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	9466	TTX'teki hücrelerde resoratores uyarılabilirliği
Tetrodotoksin	Tochris (Türkçe)	1078	Kontrollü bir madde olduğu için TTX satın almak için özel izin gerekebilir
tüm trans-Retinal	Sigma-Aldrichall trans-Retinal	R2500	Channelrhodopsin için kofaktör gerektir
Kaynaklanabilir 321 Paslanmaz Çelik Sac, 0.002 "Kalınlık, 10" Genişlik	McMaster Carr	3254K7	Özel sinek tutucu yapmak için kullanılır. Özel folyo, sağlanan PDF dosyasından pololu.com olarak lazerle kesilebilir
Diseksiyon Mikroskobu	Zeiss	Stemi 2000-C	Preparat diseksiyonu için kullanılır
Waxer	Devamı	Eectra Ağda Makinesi 66000	Diseksiyon sırasında folyoda sineği sabitlemek için kullanılır
Parafin Mumu	Ayşe	4917217	Ağda makinesi ile kullanılır
5 numara forseps	Güzel Bilim Araçları	#5CO	Diseksiyon ve kılıfın çıkarılması için kullanılır
Diseksiyon Makası	Güzel Bilim Araçları	15001-08	Diseksiyon sırasında kütikülün parçalarını çıkarmak için kullanılır
Tungsten tel	A-M Sistemleri	797500	Diseksiyon için keskinleştirilmiş iğneler yapmak için elektroliz ile kullanın
Peristaltik Pompa	Basit Pompalar (Amazon)	PM200S Serisi	TTX'i devridaim yapmak için
Peristaltik pompa için Hız Kontrol Cihazı	Zitrades (Amazon)	Yok	LED Işıklar veya Şerit için PWM Karartma Kontrol Cihazı, 12 Volt 8 Amp, Ayarlanabilir Parlaklık Işık Anahtarı Dimmer Kontrol Cihazı DC12V 8A 96W Led Şerit Işık B için
Versa montajlı hassas basınçlı hava regülatörü	McMaster Carr	1804T1	Yama sırasında pozitif basınç uygulamak için
Cam kılcal damarlar	Dünya Hassas Aletler	TW150F-3	Yama pipetleri için
Çok Amaçlı Gösterge	McMaster Carr	3846K431	Basınç regülatörü göstergesi
Elektrofizyoloji Kamerası	Dage MTI	IR-1000	IR aralığında (850 nm) çalışan herhangi bir kamera çalışacaktır. csChrimson'ı etkinleştirebileceği için kırmızı aydınlatma kullanmak istemezsiniz
Kızılötesi LED	Thorlab'lar	M850F2	Eğik aydınlatma için
IR LED için fiber optik	Thorlab'lar	M89L01	IR LED ile çiftler
Objektif lens	Olimpiyat 40X	LUMPlanFLN	Bu, çoğu mikroscipte kullanılabilir ve sinek nöronlarını görselleştirmek için iyi çalışır.
kehribar LED	Thorlab'lar	M590L3d	RFP ve mCherry'yi görselleştirmek için
Mavi LED	Thorlab'lar	M470L3d	GFP'yi görselleştirmek için
GFP filtre seti	Chroma	49011	GFP'yi görselleştirmek veya channel2rhodopsin'i uyarmak için
Özel mCherry Filtre Seti	Chroma	ET580/25X ve T600LPXR (49306 setinden itibaren), ancak ET610LP bariyer/emisyon optiği ile	Yalnızca tanımlanmış nöronları channel2rhodopsin ile yamalamak istiyorsanız kullanın
Amber ve mavi LED'i birleştirmek için Dichroic	Thorlab'lar	DMLP550R	Yalnızca mCherry altındaki yamayı kullanın ve channel2rhodopsin'i mavi ışıkla uyarın.
Kırmızı LED	LED'ler Desteklenir	Cree XPE 620 - 630 nm	CsChrimson'ı sürmek için kullanılır
LED Sürücü	LED'ler Desteklenir	3021-D-E-1000	Optogenetik stimülasyon için LED'leri sürmek için kullanılır
Manipulator	Sutter Aletleri	MP-225	Kayıtlar sırasında pipeti konumlandırmak için kullanılır
Patchclamp Amplifikatör	A-M Sistemleri	Tip 2400	Eşdeğer bir amplifikatör uygundur
Bessel Filtresi	Warner Enstrümanları	LPF 202A Serisi	Yama sırasında osiloskopa giden akım izini filtrelemek için kullanılan yardımcı filtre.
Veri Toplama Sistemi	Ulusal Enstrümanlar	NI PCIe-6321 781044-01	Amplifikatörden bilgisayara veri kaydetmek için kullanılır
Konnektör Bloğu - BNC Terminali BNC-2090A	Ulusal Enstrümanlar	779556-01	Amplifikatörü DAQ kartına bağlamak için kullanılır.
Çelik Folyo	McMaster Carr	3254K7	Özel kayıt odası için çelik folyo
Mıknatıs	K&J Manyetikler	D42	Kayıt odasını halka standına sabitlemek için
1/16" Hücreli Dökme Akrilik Şeffaf	Pololu		Özel kayıt odası yapmak için kullanılır. Akrilik, sağlanan PDF dosyasından pololu.com olarak lazerle kesilebilir