Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Stimülasyon Elektrotlarının İmalatı
- Bir stimülasyon elektrodu yapmak için, 10 cm uzunluğunda altı adet minyatür bağlantı teli kesin, kaplamanın bir ucunda 2 cm, diğer ucunda 1 cm çıkarın.
- İki kabloyu birlikte bükün ve daha kısa soyulmuş taraftan lehimleyin.
- SOT-353 (Küçük Anahat Transistör-353) kasası ile herhangi bir entegre devrenin üç bantlı ambalajından bir şerit edinin.
- Bükülmüş telleri paketin üç deliğinden geçirin. Tellerin daha uzun soyulmuş kısmı paketin boşluklarında olmalıdır. Kabloları, yalıtımın ucu deliklerin kenarı ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırın.
- Telleri sabitlemek için diş çimentosunu deliklere koyun.
Dikkat: Diş çimentosu, paketin boşluğuna sızmayı önleyecek kadar yoğun olmalıdır.
- Çimento katılaştıktan sonra (en az 10 dakika), paketi çevirin ve gözenekli çimentoya doğru su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için deliğe ince bir süper yapıştırıcı tabakası koyun. Soyulmuş telleri yapıştırmaktan kaçının.
- Kabloları daha kısa soyulmuş taraftan birlikte bükün ve lehimleyin (Şekil 1A).
- Tellerin daha uzun soyulmuş kısmını ince cımbızın ucuyla tutun, yuvarlayın ve boşluklara sarın (Şekil 1B). Gerekirse, fazla kabloyu kesin.
>2. Kayıt Elektrotlarının İmalatı
- Bir kayıt üçlü elektrodu yapmak için (Şekil 1C-D), yüksek hızlı bir döner testere kullanarak bir santimetre uzunluğunda paslanmaz çelik boru parçasını kesin. Keskin bir iğne ile kanadı borunun uçlarından çıkarın ve borunun kalıntılardan temiz ve tamamen geçirgen olduğundan emin olun.
not: Tüpü bozacağı için pense kullanmayın.
- J şeklinde bir tutucu oluşturmak için en az 3 cm uzunluğunda altın kaplama bir tahta ara pimini bükün. 'J' şeklinin daha uzun bacağını kesin ve stereotaksik cihaz tarafından tutulacak olan uzun doğrusal parça ile elektrotu tutacak ve bir ankraj noktası görevi görecek olan 'U' şekli arasında çıkarılabilir bir bağlantı yapmak için orijinal şekli geri almak için birlikte lehimleyin. Tüpü ve 'J' tutucunun kısa bacağını birbirine yapıştırın. Stabilite için gerekirse 1 cm uzunluğunda çubuklar daha yapıştırın.
- 3 adet 2,5 cm uzunluğunda elektrot telini paslanmaz çelik ultra ince makasla kesin. Kesimin net ve keskin olduğundan ve elektrot telinin dairesel yüzeyinde yalıtımın sağlam olduğundan emin olun. Ayrıca, uygulanan kuvvet nedeniyle kesilen ucun bükülmediğinden emin olun. Ayırt edilebilir hale getirmek için tellerin her birinin bir ucunu farklı açılarda (örn. bir sol düz, bir 45° ve bir dik açı) 1 veya 2 mm bükün.
- Tüpü tellerle doldurun. Deney için elektrotların uygun bir aralığını seçin (örneğin, kortikal yerel alan potansiyeli (LFP) ve akım kaynak yoğunluğu (CSD) kaydı için, tellerin uçlarının tüpün açıklığından önerilen çıkıntısı sırasıyla 4,5 mm, 4,1 mm ve 3,7 mm'dir). Uygun bir kanal sırasını korumak için hangi telin hangi derinliğe karşılık geldiğine dikkat edin.
- Teller yan yana hizalandığında ve tüpe paralel olduğunda, elektrot tellerini sabitlemek için tüpün her iki ucuna keskin bir iğne ile tek bir damla sıvı süper yapıştırıcı yerleştirin. Kılcal etki nedeniyle yapıştırıcının tüpün içine aktığından, ancak çıkıntılı uçlardaki kayıt bölgelerine doğru akmadığından emin olun.
- Kullanılacak kayıt sistemi ile uyumlu uygun bir mikro konektöre sahip bir elektrot arayüz kartı hazırlayın.
- Tellerin kayıt yapmayan, bükülmüş uçlarını, istenen kayıt kanalına karşılık gelen elektrot arayüz kartının deliklerine sokun. Tüm teller yerine oturduğunda, altın pimleri cımbızla deliklere itin.
not: Altın pimler diş çimentosu kullanılarak yerine sabitlenebilir, ancak çoğu durumda bu güvenlik adımı olmadan yeterince stabildirler.
3. Anestezi
- Hayvanı kapalı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin ve 2 L / dk tıbbi havada% 4 - 5 izofluran ile doldurun.
- Sıçan yaslandığında, hayvanı odadan çıkarın ve uygun bir havalandırma burunluğu ile stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin.
- İzofluran seviyesini %2'ye ayarlayın, ancak hava akış hızı aynı kalmalıdır. Anestezi seviyesini kontrol edin. Kıstırmaya yanıt olarak pençe çekme refleksinin yokluğu varsa, devam edin, aksi takdirde anestezi derinliğini arttırın.
- Homeotermik bir izleme sistemi ile sıçanın vücut sıcaklığını 37 ± 0,5 ° C'de izleyin ve koruyun. Korneanın kurumasını önlemek için gözlere bir damla parafin merhem sürün. Gerekirse ameliyat sırasında bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
- Hava yollarında mukus oluşumunu önlemek için deri altına 0.3 mg / kg atropin enjekte edin. Daha uzun ameliyatlar için bunu her dört saatte bir tekrarlayın. Solunumu izleyin ve gerekirse buharlaştırıcıyı ayarlayın.
4. Stimülasyon ve Kayıt Elektrotlarının İmplantasyonu
NOT: Gerekli tüm cerrahi aletleri otoklavlayın ve tüm prosedür boyunca genel asepsi ve antisepsi kurallarına dikkatlice uyun. Cerrahi alanın dışındaki steril olmayan alanlara dokunmaktan kaçının. İmplantasyondan önce elektrotları 30 dakika boyunca etil alkole (% 70) batırın.
- Bir saç kesme makinesi ile saç derisindeki saçın çoğunu çıkarın. Saç derisine tüy dökücü krem sürün, yüzeye eşit şekilde yayın ve birkaç dakika bekleyin. Kremi ve kalan tüyleri nazikçe çıkarmak için bir spatula kullanın. Cildi suyla durulayın, ardından dezenfektanla durulayın.
- Cildi uyuşturmak için deri altına% 1 - 2 lidokain (toplam 7 mg / kg dozu aşmayın) enjekte edin. Gözler için tek bir damla veteriner merhemi uygulayın (örneğin, parafin).
- Alından boyuna kadar bir neşter ile orta hatta kapsamlı ve uzun (~ 2 cm) bir sagital kesi yapın. Periosteum da dahil olmak üzere dokuları kafatasından çıkarın. Daha sonra, bir keski veya diş cımbızı kullanarak, iki temporal kemiğin kıvrımları arasındaki alanı temizleyin. Kafatasını açıkta tutmak için dört bulldog kullanarak disseke edilmiş cildi geri çekin.
- Temporal kemiğin dik kenarı ile kaslar arasına nazikçe ince cımbız yerleştirin ve ayırın. Kaslara zarar vermeden, tercihen oksipital kemiğin kenarından koronal sütürlerin düzlemine kadar, temporal kemiğin geniş yüzeyinin mümkün olduğunca fazlasını ortaya çıkarmak için jigging hareketleri yapın.
- Temporal kemikleri açıkta tutmak için ekartörleri iki zamanlı olarak yerleştirin.
- Kafatasının yüzeyini 1-2 mL% 3 hidrojen peroksit (H2O2) ile durulayın, ardından 1-2 mL su ile yıkayın.
- Temporal kemiklerin yüzeyini çok dikkatli bir şekilde havayla kurutun, nemi oküler çubuklarla silin. Stimülasyon elektrotlarının temizlenmiş dikey kafatası yüzeyine oturup oturmadığını test edin (stimülasyon elektrodunun üst kenarı, temporal kemiğin cristasının kenarı ile aynı hizada olmalıdır). Gerekirse, buldozerleri ve ekartörleri yeniden ayarlayın veya stimülasyon elektrotlarını makasla şekillendirin.
- Stimülasyon elektrotlarının boşluklarını elektroiletken jel ile doldurun ve elektrotların kenarına ince bir tutkal tabakası sürün.
- Stimülasyon elektrodunu tek bir doğru hareketle temporal kemiğin kuru yüzeyine yerleştirin ve ince cımbızla bir dakika boyunca sıkıca yerinde tutun. Yapıştırıcı ile nem temas etmediğinden emin olun. Gerekirse oküler çubuklarla silin.
Dikkat: Elektrot kararsız hale gelirse, çıkarın. Kemiği temizledikten sonra, bu adımı yeni bir stimülasyon elektrodu ile tekrarlayın.
- Stimülasyon elektrodunun kenarlarına diş çimentosu koyun, dokulardaki sızan nemi oküler çubuklarla sürekli kurutun. Ardından, tüm stimülasyon elektrodunu çimento ile kaplayın.
- Çimento tamamen sertleştikten sonra, bu adımları karşı tarafta tekrarlayın.
- Vidaları sabitlemek için kafanın her yerine birkaç delik açın. Minyatür vidaları deliklere sürün ve üzerlerine diş çimentosu koyun. Vida çapına kıyasla ~%10 daha küçük çaplı bir matkap kafası kullanın.
- Deneylerin amacına bağlı olarak, ya kabloların uçlarına bir konektör lehimleyin, yüzeye yerleştirin ve çimento ile örtün ya da kayıt elektrotlarını ve optik fiberleri implante etmeye devam edin ya da kafatasının üzerine bir kraniyal pencere hazırlayın. Bu ikinci durumda, konektörleri lehimleyin ve bunları yalnızca sonunda yapıya sabitleyin. Uzun süreli eş zamanlı TES ve LFP kayıtlarına ihtiyaç duyulması durumunda, tek teller yerine yukarıda belirtilen elektrot üçlülerini implante edin.
not: Bu kurulum, ortak mod stimülasyon artefaktlarının kaldırılmasına izin verir8. Elektrot implantasyonunun kaydedilmesiyle ilgili ayrıntılar için önceki protokollere bakın.
- Açıkta kalan mendilleri bol miktarda dezenfektan ile yıkayın. Deri altına %1-2 lidokain enjekte edin (toplam 7 mg / kg dozu aşmayın).
- Yara kenarlarını debride edin ve konektör/implant etrafında basit kesintili dikişlerle kapatın. Daha sonra yarayı povidon-iyot ile dezenfekte edin.
- Deri altına 5 mg / kg karprofen enjekte edin. Gerekirse bunu tekrarlayın.
not: Yerel etik izin kurulu tarafından belirlenen gerekliliklere uyan başka herhangi bir analjezik kullanılabilir.
- Anesteziyi askıya alın, kulak çubuklarını ve burunluğu serbest bırakın ve bilincini yeniden kazanmak için hayvanı ameliyat sonrası iyileşme kafesine koyun.
- Ameliyat sonrası ilk saatlerde hayvanın yakın gözetim altında olduğundan emin olun. İmplant bölgesini periyodik olarak izlemeye devam edin.
not: Hayvan, sternal yaslığı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmamalıdır. Hayvanı, prosedürden tamamen iyileşene kadar bireysel olarak barındırın.
