Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşakta Sinaptik Akımların Kaydedilmesi

Özet

Kaynak: Vasin, A., et al. Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşağından Sinaptik Akımların Fokal Makroyama Kayıtları. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, Drosophila larvasının nöromüsküler kavşağındaki sinaptik bir bouton'dan sinaptik akımları kaydetme tekniğini göstermektedir. Bu teknik, gelişmiş spontan veya asenkron sinaptik aktiviteye sahip mutant sinek hatlarının incelenmesi için önemli olan tek bir sinaptik bouton aktivitesinin izlenmesini sağlar.

Protokol

1. Kayıt Elektrotlarının İmalatı

1. Cam elektrotların çekilmesi
   1. Mikroelektrot çektirmesi için aşağıdaki protokolü kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız):
      1. Satır 1: Isı 510 Çekme - Hız 30 Zaman 250; Hat 2: Isı 490 Çekme - Hız 30 Süre 250.
         not: Zaman birimleri, birim başına 0,5 ms'ye karşılık gelir; Diğer birimler görecelidir. Rampa testi yapıldıktan sonra her filament için ısının değeri ayarlanmalıdır.
   2. Çekilen elektrotun iç çapının 7 - 10 μm aralığında olduğundan emin olmak için bir mikroskop (35x büyütme) kullanın (Şekil 1A). Toz birikmesini önlemek için kılcal damarları sıkıca kapalı kaplarda saklayın.
2. Yangın parlatma
   1. Mikro dövme kullanarak kılcal damarları (1 - 2 sn boyunca maksimum ısı değerinin% 80 - 90'ı) ateşleyin (bkz. Cilalı elektrotun son iç çapının 5 μm olduğundan emin olun (Şekil 1A).
3. Bükme
   NOT: Elektrodu yüksek büyütme objektifi altında kasın üstüne yerleştirmek için iki büküm yapılır.
   1. Şekil 1B'de gösterilen cihazı kullanın. Elektrodu manipülatöre sabitleyin ve ucu dokunmadan filamentin üzerine yerleştirin.
   2. Isı değerini maksimumun %60 - 70'ine ayarlayın ve filamenti ısıtmak için mikro dövme pedalına 1 - 2 saniye basın (Malzeme Tablosuna bakın). Elektrotun ucunu yavaşça aşağı çekmek için L şeklinde bir iğne kullanın (Şekil 1B büyütülmüş). Bükümü yaklaşık 90°C'de yapın (Şekil 1C).
   3. Elektrodu forseps kullanarak elinizle torcun alevi üzerinde tutun ve ikinci bükümü ilk bükümden 7 - 10 mm mesafede ve yaklaşık 120^{° '}lik bir açıyla yapın (Şekil 1C).

2. Ek Hazırlık Adımları

1. Hemolenf benzeri (HL3) çözelti hazırlayın (mM cinsinden): 70 sodyum klorür (NaCl), 5 potasyum klorür (KCl), 20 magnezyum klorür (MgCl₂), 10 sodyum hidrojen karbonat (NaHCO₃), 5 trehaloz, 115 sakaroz, 5 N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve 1 mM kalsiyum klorür (CaCl₂); pH'ı 7.3 - 7.4'e ayarlayın. Solüsyonu buzdolabında saklayın ve her hafta taze yapın.
2. Stimülasyon pipetlerini, cam pipetleri kaydetmekle aynı şekilde yapın, ancak onları bükmeye gerek yoktur.
   not: Stimülasyon elektrotlarının hazırlanması 28 ve 27'de ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Yangın parlatma işleminden sonraki son çap 5 - 7 μm aralığında olmalıdır.
3. Bir şırıngaya bağlı bir mikroelektrot tutucusuna bir stimülasyon pipeti yerleştirin.

3. Uyarıcı bağlantı akımlarının (EJC'ler) elektriksel kayıtları

1. Kayıt
   1. Preparatla birlikte petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin (Şekil 2). Referans elektrodunu banyoya yerleştirin.
   2. Kayıt elektrodunu HL3 solüsyonu ile doldurun. 10x objektif altında (bkz. Malzeme Tablosu), elektrodu banyoya daldırın ve mikromanipülatörü kullanarak karın segmentleri 2, 3 veya 4'ün 6. ve 7. kaslarının üzerine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 3 A.1 ve A.2).
   3. Hedefi 60x olarak değiştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Epi-floresan veya DIC optiği kullanarak ilgilenilen alana odaklanın. Elektrotun ucunu sinaptik butonun üzerine yerleştirin (Şekil 3 B.1-3).
   4. Elektrodu kasın üzerine çok nazikçe bastırın. Aşırı basınç, nöromüsküler kavşağa (NMJ) zarar verebilir veya spontan sinaptik aktivitede bir artışa neden olabilir. Elektrotun ucunun tıkalı olmadığından emin olun - eğer öyleyse değiştirin.
   5. Amplifikatörü, A/D kartını ve bilgisayarı açın.
   6. Amplifikatörde voltaj kelepçesi modunu seçin.
   7. Edinme yazılımını başlatın ve 'boşluksuz' modu seçin.
   8. Bilgisayar ekranında minyatür uyarıcı bağlantı akımlarının (mEJC'ler) görünümünü gözlemleyin.
   9. mEJC'lerin genliğinin 0,2 - 0,7 nA.
      aralığında olduğundan emin olun not: Daha küçük EJC'ler, kayıt elektrodunun kusurlu olduğunu veya doğru şekilde yerleştirilmediğini gösterir.
2. Uyarım
   1. Bir mikromanipülatör kullanarak, görsel kontrol altında, stimülasyon elektrodunu akson innerve edici karın segmentleri 2 - 4'ün yakınına yerleştirin.
   2. Elektrot tutucusuna bağlı şırınganın pistonunu, akson elektrotun içine çekilecek şekilde çekerek negatif basınç uygulayın (Şekil 2).
   3. Stimülatörü açın. Sıfır akımı ayarlamak için izolasyon ünitesindeki düğmeyi çevirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından EJC'ler görünene kadar (veya eşiğe ulaşılana kadar) yavaşça artırın.
   4. Stimülasyonu, EJC'lerin gözlemlenmesi için eşik eşiğine kıyasla stimülasyon akımı yaklaşık iki kat arttırılmış olarak eşik üstü bir rejimde gerçekleştirin.
      not: Deneyimlerimize göre, bu tür bir stimülasyon yoğunluğu, aksiyon potansiyel arızalarını ve aksiyon potansiyeli ateşlemesini önlemek için optimaldir. Örneğin, EJC'ler 0,2 mA'lık stimülasyon akımında görünüyorsa, deney boyunca 0,4 mA'lık bir akım kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1. Mikropipet üretiminin son adımları. (A) Çekme ve yangın parlatma işleminden sonra elektrot uçları. (B.1) Uç bükme kurulumu. (B.2) Kutulu alan sağda büyütülmüş olarak gösterilmiştir. Elektrot ve filament, elektrot ucu telin biraz üzerine yerleştirilecek ve birbirine değmeyecek şekilde sabitlenir. (C.1) Kayıt elektrodu. (

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mikro meşale 1WG61	Tahıl Makinası	1WG61	Mikro meşale
Olympus BX61WI	Olympus	BX61WI	Dik mikroskop
Olympus Lumplan FL N 60x	Olympus	UPLFLN 60X	Mikroskop objektifi 60X
Olympus UPlan FL N 10x	Olympus	Uplanfl N 10X	Mikroskop objektifi 10X
Narishige Mikromanipülatör	Narishige (Narishig)	MHW-3	Üç Eksenli Su Hidrolik Mikromanipülatörü
npi Elektronik GmbH ELC-03XS	npi Elektronik GmbH	ELC-03XS	Elektrofizyolojik amplifikatör
A.M.P.I Usta 8	A.M.P.I.	Yüksek Lisans 8	Elektrik stimülatörü
A.M.P.I Iso-Flex	A.M.P.I.	Iso-Esnek	Uyaran izolatörü
TMC titreşim önleyici tablo	TMC (Türkçe)	63-9090	Titreşim önleyici tablo
TMC Faraday kafesi	TMC (Türkçe)	81-333-90	Faraday kafesi
Dijital veri 1322A	Akson Aletleri	Dijital veri 1322A	Dijital veri
bilgisayar	Dell	Dell Boyut 5150	Win XP işletim sistemine sahip bilgisayar
Elektrot tutucu	TEFE	MEH3SW	Elektrot tutucu
Optik filtre	Omega optik	XF 115-2	Yeşil Floresan Protein (GFP) tespiti için filtre küpü
pCLAMP 8	Akson Aletleri	8.0.0.81	Sinyal kaydı için yazılım
Quantan (Nicelik)	Şirket içi yazılım	-	Sinyal işleme yazılımı
Kanton-S (Vahşi Tip)	Bloomington Stok Merkezi	64349	Uçuş hattını kontrol edin
cpx SH1	J.T. Littleton'ın Cömert Hediyesi	-	Artmış spontan ekzositoz ile kompleksin nakavt sinek hattı
CD8-GFP	Bloomington Stok Merkezi	5137	Nöronal floresan (GFP) Etiketi ile uçuş hattı

Serisi dijital fotoğraf makinesi Serisi