$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Sistem Kurulumu
- Basınç kontrol ünitesini oluşturun.
- Basınç kontrol ünitesini devre haritasına göre monte edin (Şekil 1). Elektrik devresi şemalarına göre üretilmiş Baskılı Devre Kartına (PCB) gerekli parçaları lehimleyin (Şekil 1b). Standart dirençler, LED'ler (Işık yayan diyotlar), Metal Oksit Yarı İletken alan etkili transistörler (MOSFET'ler), kapasitörler ve konektörler kullanın. Solenoid valfleri PCB'ye lehimleyin (Baskılı devre kartı). Hava pompasını ve hava basıncı sensörünü bir elektrik kablosuyla PCB'ye bağlayın.
NOT: Gerekli tüm parçalar temin edildikten sonra, basınç kontrol ünitesi yaklaşık 2 saat içinde inşa edilmelidir.
- İkincil veri toplama (DAQ) kartını bağlayın.
- Baskılı devre kartından gelen veri çıkışlarını Tablo 1.
aşağıdaki şekilde DAQ kartına bağlayın
not: DAQ kartı "Tek uçlu modda" çalışacaktır. Bağlantı noktası haritası kullanım kılavuzundadır (Malzeme Tablosuna bakın).
- "AIn Pr S"yi analog giriş (AI) kanallarından birine ve "R-Gr"yi ikincil DAQ kartındaki analog topraklamalardan birine bağlayın.
- Amplifikatörden gelen birincil çıkışı AI kanallarından birine ve toprağı ikincil DAQ kartının analog toprağına bağlayın.
NOT: Amplifikatörden birincil çıkışı bağlamak için standart bir BNC kablosu kullanılabilir.
- Diğer ucunu soyun ve pozitif sinyali (yani bakır çekirdek) AI kanalına ve toprağı (yani çekirdeğin etrafındaki ince tel) analog toprağa bağlayın. Birden fazla yama kanalı kullanılıyorsa ikinci bir kanal için bu adımı tekrarlayın.
NOT: DAQ kartına giden analog giriş sonraki adımlarda yapılandırılacaktır.
- Gücü ikincil DAQ kartının güç çıkışına bağlayın. Pompa için ayrı bir 12 V güç kaynağı kullanın.
- Boruyu bağlayın.
- Hava pompasını ve iki valfi bağlayın.
- Son adımda, yumuşak boruyu valf 2 üst portundan basınç sensörüne ve pipet tutucuya bağlamak için 3 bir konektör kullanın.
- İki pipet kullanılıyorsa, pipet tutucuya bağlı boruya başka bir 3 konektör ekleyin. Yama yaparken, valfler ve kullanılan pipetler arasında manuel olarak geçiş yapın.
- Autopatcher IG.
yükleyin
NOT: Sistem gereksinimi: Autopatcher IG yalnızca Windows 7 çalıştıran bir bilgisayarda test edilmiştir. Diğer işletim sistemleri için doğrulanmamıştır. Açıklanan prosedür, özellikle Malzeme Tablosunda listelenen donanım için geçerlidir.
- Autopatcher-IG'yi GitHub'dan (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG) indirin.
- Python'u yükleyin (sürüm ve indirme adresi için Malzeme Tablosuna bakın).
- Komut satırına "pip uninstall PyQt4" yazarak PyQt4 kitaplığını kaldırın terminal.
not: Sistem, Qwt ve Opencv kitaplıklarıyla uyumluluk sağlamak için PyQt4 kitaplığının eski bir sürümünü kullanır.
- Python kitaplıklarını geçmiş tekerlek dosyalarından (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/) yükleyin. Şu dosyaları bulun: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) ve Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- Tekerlek dosyalarını yüklemek için, dosyaların kaydedildiği dizine gidin ve "pip install ***wheelfilename***.whl" yazın. "***wheelfilename***" yerine dosyanın gerçek adını yazın.
NOT: Tekerlek dosya adındaki "cp27" Python 2.7'yi, "win32" ise Windows 32-bit'i belirtir. "Win32" çalışmıyorsa, "win64" deneyin.
- CCD (şarj bağlantılı cihaz) kamerayı kontrol etmek için 64 bit (https://www.qimaging.com/support/software/) yükleyiciyi indirin ve yükleyin. Ardından Python'da kamerayı kontrol etmek için 64 bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) için MicroManager'ı indirin.
- Manipülatörleri ve mikroskop aşamasını kontrol etmek için üretici tarafından sağlanan kontrol yazılımını yükleyin.
not: Bunu yaparak, manipülatörleri kontrol etmek için gerekli sürücü de kurulur. Yükleme paketi genellikle bir CD-ROM'da sağlanır.
- İkincil DAQ kartını kontrol etmek için, DAQ kartının satın alınmasıyla birlikte verilen CD-ROM'dan Evrensel Kitaplığı yükleyin.
- Autopatcher IG için donanımı yapılandırın.
- Mikroskop tablası ve manipülatör kontrolörlerini USB bağlantı noktaları aracılığıyla bilgisayara bağlayın.
- COM bağlantı noktası numaralarını ünite 0: mikroskop aşamasına, ünite 1: sol manipülatöre ve ünite 2: sağ manipülatöre bu sırayla "yapılandırma" klasöründeki "ports.csv" konfigürasyon dosyasına atayın. ports.csv dosyasındaki diğer parametreleri (yani "SCI" ve "1") değiştirmeden bırakın.
not: COM bağlantı noktası numarası bilgileri, üretici tarafından sağlanan manipülatör yapılandırma yazılımı çalıştırılarak bulunabilir. "Ayarlar" sekmesine gidin, "ayarlar" ve "Hareket" sayfasını seçin ve üst kısımdaki her sekmenin etiketlerini okuyun. Alternatif olarak, bu bilgiler PC Aygıt Yöneticisi'nde bulunabilir.
- Bir basınç sensörü ve yama kanalı 1 ve 2 (ünite 1 ve 2'ye karşılık gelir) için DAQ kartına analog giriş kanal numaraları atayın. "Yapılandırma" klasöründeki "DAQchannels.csv" dosyasına kanal numarasını girin.
not: Değişiklikleri kaydederken bilgileri değiştirebileceğinden, .csv dosyalarının elektronik tablo yerine Not Defteri uygulamasıyla açılması önerilir.
- Autopatcher IG'yi çalıştırın.
- Amplifikatörü, mikroskop denetleyicisini ve manipülatör denetleyicisini açın. Amplifikatör yazılımının çalıştığından emin olun.
- Autopatcher IG'yi Python ile bir komut satırı terminalinden aşağıdaki gibi çalıştırın: önce Autopatcher IG'nin kurulu olduğu dizini (en yaygın terminaller için "cd" komutu) değiştirin, komut satırı terminaline "python Autopatcher_IG.pyw" yazın ve "Enter" tuşuna basın.
NOT: Autopatcher IG'yi çalıştırmadan önce manipülatör kontrol yazılımını çalıştırmayın çünkü mikroskop aşamasını ve manipülatörü işgal ederek Autopatcher IG'nin donanımı bulamamasına neden olur. Manipülatör kontrol yazılımı, kontrol edilecek ek modüller varsa (örn. hat içi ısıtıcı) Autopatcher IG tamamen başlatıldıktan sonra çalıştırılabilir.
- Birincil pipeti kalibre edin.
- Yama pipetlerini çekin. Çekilmiş bir cam pipeti dahili bir solüsyonla doldurun ve kafa aşamasına yükleyin.
NOT: Boş cam pipetler mikroskop altında farklı kontrastlara sahiptir ve yanlış kalibrasyona neden olabilir.
- Pipet ucunu mikroskobun görüş alanına getirin ve odak noktasına getirin. Manipülatörleri ve/veya mikroskop aşamasını hareket ettirmek için tuş takımı kullanılıyorsa, klavyede "z" tuşuna basarak koordinatları güncelleyin.
not: Koordinatlar gerçek zamanlı olarak güncelleneceği için hareketi kontrol etmek için klavye (mikroskop aşaması: A/D - x ekseni, W/S - y ekseni, R/F - z ekseni; manipülatörler: H/K - x ekseni, U/J - y ekseni, O/L - z ekseni, 1/2 - birim numarası) kullanılıyorsa bu işlem gerekli değildir.
- Pipetin yüklendiği ilgili ünite için ana Grafik Kullanıcı Arayüzündeki (GUI) "Kalibrasyonu başlat" düğmesine tıklayın (Şekil 2).
not: Kalibrasyon bittiğinde bir açılır pencere görünecektir.
NOT: Kalibrasyon otomatik olarak gerçekleştirilecek ve bu işlem yaklaşık 3,5 dakika sürecektir. Aynı düğmeye tıklamak (kalibrasyonu başlattıktan sonra şimdi "kalibrasyonu iptal et" olarak değiştirilmiştir) kalibrasyon girişimini iptal edecektir.
- Ana GUI'nin altındaki "kalibrasyonu kaydet"e tıklayarak kalibrasyonu kaydedin (her iki manipülatör için mevcut kalibrasyonu kaydeder ve gelecekte yüklenebilir).
NOT: İkincil kalibrasyonun düzgün çalışması için düşük (4 veya 10X) ve yüksek (40X) büyütme altındaki görüş alanının hizalanması gerekir. Hizalama prosedürleri için lütfen kullanılan optik sistemin kullanım kılavuzuna bakın.
2. Otomatik Yama Kelepçesi Prosedürü
- Akut beyin dilimleri hazırlayın
- Yama kelepçesi için cam pipetler hazırlayın.
- Kayıt odasının ortasına bir beyin dilimi yerleştirin. Dilimi bir dilim basılı tutma veya "arp" ile sabitleyin.
- Floresan hücreyi tespit edin.
- 4X lensin altında ilgi alanınızı bulun. Tıkla ve taşı ("CTM") modunu açarak ve ilgilenilen alanın merkezini tıklatarak mikroskop aşamasını hareket ettirin. Alternatif olarak, mikroskop tablasını hareket ettirmek için tuş takımını kullanın (A/D - x ekseni, W/S - y ekseni, R/F - z ekseni).
- Yüksek büyütmeli lense geçin ve tuş takımındaki R/F'yi kullanarak mikroskobu z ekseninde hareket ettirerek odağı ayarlayın.
NOT: Su banyosu seviyesinin, düşük ve yüksek büyütmeli lenslerin altındaki odak düzlemi z ekseninde aynı veya benzer olacak şekilde ayarlanması önerilir.
- Ana GUI sütunu olan "Ünite 0"daki "Hücreyi Algıla" düğmesine tıklayın. Kurulumun LED'i veya lazer ışık kaynağı TTL sinyali tarafından kontrol edilemiyorsa, LED'i/lazeri manuel olarak açın; hücre algılama bittiğinde bir açılır pencere görünecektir.
- Gerekirse LED'i/lazeri kapatın; "Bellek konumları" GUI'sinde hücre koordinatlarının bir listesi görünecektir. Koordinatların yanındaki "X" düğmesini tıklayarak istenmeyen hücreleri listeden kaldırın.
- Alternatif olarak, hedef hücreler floresan olarak etiketlenmemişse, ana GUI'de "Fare modu"na tıklayın. İlgilendiğiniz hücreye tıklayın; Hücrede bir sayı içeren sarı bir nokta görünecek ve hücrenin koordinatları "Bellek konumları" GUI'sinde görünecektir.
- İkincil pipeti kalibre edin.
- Bir cam pipetin 1 / 3'ünü iç solüsyonla doldurun. Pipeti, baş aşamasına takılı pipet tutucusuna yükleyin.
- Düşük büyütme oranına sahip lensi kullanın. Pipeti görüş alanına getirin ve tuş takımını kullanarak odağı ayarlayın (Y/K - x ekseni, U/J - y ekseni, O/L - z ekseni). Ünite 1 ve ünite 2 arasında geçiş yapmak için "1" ve "2"yi kullanın.
- "Yük kalibrasyonu"na tıklayarak birincil kalibrasyonu yükleyin. Kullanımda olan ünitenin altındaki ana GUI'deki "İkincil kalibrasyon" düğmesine tıklayın. Örneğin, ünite 2 kullanımdaysa, "Ünite 2" sütunundaki "İkincil kalibrasyon" düğmesine tıklayın. Yüksek büyütme oranına sahip lense geçmek için açılır pencere talimatlarını izleyin.
- Bir hedef hücreye yama yapın.
- "MultiClamp" (yani amplifikatör) yazılımının çalıştığından emin olun. "Yama kontrolü" GUI'sini açmak için "Yama kontrolü" düğmesine tıklayın; Bu GUI'yi açmak birkaç dakika kadar sürebilir.
- Ana GUI "Birim 40" sütunundaki "40X" seçeneğini işaretleyerek 0X büyütme lensini kullanın. "Bellek konumu" GUI'sindeki koordinat listesindeki ilgili hücrenin yanındaki "git" düğmesini tıklayın; Mikroskop hücreye hareket edecektir.
- Bir fare tıklamasının ardından hareketi etkinleştirmek için ana GUI'de kullanılan ünitenin CTM düğmesine tıklayın. İlgilendiğiniz hücreye tıklayın; Pipet ucu hücreye doğru hareket edecektir.
- "Yama kontrolü" GUI.
üzerindeki "Yama" düğmesine tıklayın
not: Otomatik yama işlemi başlar ve basınç ve direnç "Yama kontrolü" GUI'sinde izlenebilir.
- Giriş sinyalini iki ünite arasında değiştirmek için "Ünite 1 seçildi" düğmesini kullanın.
NOT: Sistem hedef hücreye yaklaşacak, negatif basınç uygulayacak, hücre zarı potansiyelini eşleştirecek ve bir dizi basınç ve direnç eşiği ve mantığına dayalı olarak gigaseal oluşumunu tespit edecektir.
- "Yama kontrolü" GUI'sindeki ilgili düğmelere tıklayarak otomatik işlemi herhangi bir noktada manipüle edin. Örneğin, yama denemesini iptal etmek için tekrar "Yama" düğmesine tıklayın ve eşikten bağımsız olarak yama sürecini bir sonraki adıma ilerletmek için "Sonraki aşama"ya tıklayın.
NOT: Bir açılır pencere, bir gigaseal oluştuğunda kullanıcıyı bilgilendirecek ve büyük negatif basınçla birlikte zap uygulama seçeneği sunulacaktır.
- Kombine zap ve emme ile içeri girmek için "Evet"i seçin. Alternatif olarak, yalnızca emme ile içeri girmek için "Hayır"ı seçin.
NOT: Başarılı bir tam hücre yaması tamamlandığında, kullanıcıya deney yama günlüğünü kaydetmesi için bir açılır pencere açılacaktır.
- Deneme yama günlüğünü kaydedin.
NOT: Bir yama denemesi başarısız olursa, bir açılır pencere kullanıcıyı bilgilendirir ve yama işlemi sıfırlanır.
- Adım 2.4'e geri dönün ve adımları farklı bir hücreyle tekrarlayın.