Bir Ex Vivo Sıçan Kolonunda Kolon Afferent Sinirlerinden Elektrofizyolojik Kayıt

Özet

Kaynak: Meng, Y. et al., Sıçanlarda Kolonik Afferent Liflerin Elektrofizyolojik Özelliklerinin İn Vitro Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, her iki uçta kanüle edilmiş ve intraluminal basıncı artırmak için salin ile infüze edilmiş bir ex-vivo sıçan kolonundaki kolonik afferent sinirlerin aktivitesini kaydetmek için bir yöntemi göstermektedir. Basınç arttıkça, sinir sinyali yükselir ve uyarıldığını gösterir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Perfüzyon Çözeltisi ve Test Bileşiklerinin Hazırlanması

1. 5 L Krebs çözeltisi hazırlayın: 113 mM sodyum klorür, NaCl, 5.9 mM potasyum klorür, KCl, 1.2 mM Di-hidrojen sodyum fosfat, NaH₂PO₄, 1.2 mM magnezyum sülfat, MgSO₄, 25 mM sodyum bikarbonat, NaHCO₃, 1.2 mM kalsiyum klorür, CaCl₂ ve 11.5 mM glikoz. Çözeltiyi %95 O₂ +% 5 CO₂ gaz karışımı ile doyurun. Buzdolabında ~500 mL oksijenli Krebs'i önceden soğutun.
2. Gerektiği gibi stok test bileşiklerinin (etanol içinde 1 mM kapsaisin ve salin içinde 10 mM 5-hidroksitriptamin (5-HT)) alikotlarını hazırlayın. Stoku Krebs (banyo uygulaması için) ve tuzlu su (intraluminal uygulama için) içinde kullanımdan hemen önce son konsantrasyona kadar seyreltin.

2. Kayıt elektrodunun hazırlanması

1. Kayıt elektrodunu, geleneksel bir elektrot çektirme kullanarak iç filamentleri olmayan (1,5 mm dış çap) standart cam tüplerden çekin. Isı ve çekme için çektirme ayarlarını, çekilen elektrotların şaftı 20 ila 25 mm arasında olacak şekilde ayarlayın.

3. Doku Toplama

1. Sodyum pentobarbital (80 mg / kg, ip) kullanarak fareyi derinlemesine anestezi altına alın.
2. Steriliteyi sağlarken, neşter kullanarak karın duvarında orta hat kesisi yaparak karın boşluğunu ortaya çıkarın. Kolorektumu ortaya çıkarmak için mezenter ve diğer dokuları bir kenara çekin.
3. Hayvanı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Dikkatli bir diseksiyon ile sol pelvik ganglionu (PG) bulun ve ona katılan pelvik sinirleri (PN) ve lomber splanknik sinirleri (LSN) tanımlayın. Bu sinirleri PG.
   not: PG, kolorektal bileşkeye yakın bir yerde bulunur. Tipik olarak, lumbosakral omurilikten 3-4 PN ve PG'ye bir LSN projesi (Şekil 1).
4. Rektumu ortaya çıkarmak için simfiz kemiğini kesin. Kolorectumun üzerindeki dokuları (yani idrar kesesi vb.) çıkarın; PG'yi sağlam bırakmaya dikkat edin.
5. Aşırı dozda pentobarbital intravenöz enjeksiyonu ile sıçanı feda edin. Kolonu PG'nin yaklaşık 3 cm yukarısından geçirin ve kolorektumu forseps kullanarak hayvandan çıkarın.
6. Kolorectum'u önceden soğutulmuş Krebs çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Kolonu nazikçe yıkayarak dışkıyı çıkarın. Kalan idrar kesesini ve diğer dokuları PG'den ödün vermeden dikkatlice çıkarın.

4. Kolonik Afferent Sinirlerin Diseksiyonu

1. Kolonu bir kayıt odasına (20 mL) yerleştirin ve dokuyu sürekli olarak karbojene Krebs çözeltisi ile perfüze edin. Perfüzyon hızını 15 mL / dk'ya ayarlayın.
2. Kolorektumu hem oral hem de anal uçlarda kanüle edin. Kolonun intraluminal infüzyonunu oral ila anal yönde 10 mL / s oranında salin ile başlatın.
3. Diseksiyon mikroskobu altında ana PG'yi bulun. Ganglionu ortaya çıkarmak için böcek pimleri kullanın. Dikkatli bir diseksiyonla, gangliondan çıkan ve kolona doğru uzanan ince bir sinir dalı bulun (Şekil 1). Gangliona yakın siniri kesin.
   NOT: Şekil 1, PG'nin distalindeki bir sinir dalından bir kaydı göstermektedir. Sinir muhtemelen pelvik ve lomber splanknik afferent liflerin bir karışımını içerir. Alternatif olarak, PN ve/veya LSN'den PG'ye yakın bir kayıt yapılabilir.
4. Isıtma banyosunu açın ve hazne sıcaklığını 34 ± 0,5 °C'de tutmak için Krebs solüsyonunu ısıtın.

5. Emme elektrodunun hazırlanması

1. Önceden çekilmiş bir cam pipet alın (adım 2) ve diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Elektrodun ucunu, kaydedilecek sinirin çapı ile uyumlu büyüklükte olacak şekilde bir pens ile kırın.
2. Ucu daha hafif bir parlamaya yakın yerleştirerek eğim verin.

6. Elektrofizyolojik Kayıt

1. Eğimli elektrodu elektrot tutucusuna bağlayın. Elektroda negatif veya pozitif basınç uygulamak için tutucudaki yan bağlantı noktasına 10 mL'lik bir şırınga bağlayın.
2. Tutucuyu biyonun baş sahnesine bağlayınampkaldırıcı ve başlığı monte edintage bir manipülatöre.
3. Elektrodu doku banyosuna taşıyın ve tutucunun gümüş teline temas edene kadar hafifçe emme uygulayarak elektrodu Krebs solüsyonu ile doldurun. Elektrot ucunu sinirin kesilen ucuna yakın bir yere yerleştirin ve siniri elektrot içine emmek için negatif basınç uygulayın. Sinirin ~ 1 mm'si elektrot içine çekilecek ve sıkı bir sızdırmazlık oluşturacak şekilde daha fazla negatif basınç uygulayın.
4. Biyoamplifikatörü açın ve filtreyi 300 - 3.000 Hz'e ayarlayın. Osiloskoptaki sinyali izleyin ve spike veri işleme yazılımına sahip bir bilgisayar kullanarak sinir sinyalini (20 kHz örnekleme hızı) ve intraluminal basınç sinyalini (100 Hz örnekleme hızı) kaydedin.

7. Kolonik Afferent Duyarlılığın Test Edilmesi

1. Sürekli intraluminal infüzyon yaparken çıkış kanülü üzerindeki üç musluğu kapatarak kolonun rampa distansiyonunu uygulayın. İntraluminal basıncı 60 mmHg'ye ulaşana kadar izleyin, bu sırada boşaltma kanülü üzerindeki üç musluğu açın.

Sonuçlar

Şekil 1. Sıçan Kolonik Afferent Sinirlerinin İn Vitro Elektrofizyolojik Kaydı. Bir. Sıçanın ex vivo "tüp" kolon preparatının şematik bir gösterimi. Kolorektum, bağlı PG ile kayıt odasında süper kaynaştırılır ve her iki uçta kanüle edilir. İntraluminal infüzyon bir şırınga pompası kullanılarak elde edilir ve oral yönde anal yönde hareket eder. Kolonun distansiyonu, çıkış kanülü üzerin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum Pentobarbital	Şanghay Westang Biyo-Teknoloji	B558
Kapsaisin	Sigma	M2028
Elektrot çektirme	MicroData Enstrüman A.Ş.	PMP107 Tezli Yüksek Lisans
Nörolog Sistem (Biyoamplifikatör)	Sayısallaştırıcı, Ltd	Nörolog Sistemi
A/D dönüştürücü	Cambridge Elektronik Tasarımı	Mikro1401
Veri işleme yazılımı	Cambridge Elektronik Tasarımı	Spike2 sürüm 6
Gümüş tel	Dünya Hassas Aletler	EP12
Cam tüpler	Dünya Hassas Aletler	1B150-4
Elektrot tutucu	Dünya Hassas Aletler	MEH3SBW
Isıtma banyosu	bahşetmek	GR150
Diseksiyon mikroskobu	Leica Belediyesi	Yakınlaştırma2000
Diseksiyon mikroskobu	Dünya Hassas Aletler	PZMIII-BS
çakmak	herhangi	Na
Cerrahi aletler	Dünya Hassas Aletler	Na
Böcek pimleri	0,1 mm paslanmaz çelik telden ev yapımı	Na
Üç manipülatör	Dünya Hassas Aletler	KITF-R
Sıçan	herhangi	Na	Herhangi bir suş / cinsiyet kullanılabilir.

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi