Serebral vasküler endotel hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Rellick, S. L. et al. Serebral Vasküler Endotel Hücrelerinde Biyoenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, hücre dışı akı testi kullanılarak serebral vasküler endotelyal (CVE) hücrelerin mitokondriyal işlevinin değerlendirmesini göstermektedir. CVE hücreleri, hücre dışı bir akı hücre kültürü plakasında kaplanır. Hücre dışı akı sensörleri, biyoanalizöre yüklenmeden ve kalibrasyondan önce hidratlanır. Hücreleri içeren plaka daha sonra analiz için yüklenir.

Protokol

>1. Serebral Vasküler Endotelyal (CVE) hücreleri Hücre Kültürü Plakalarında Tohumlayın ve Tedavi Edin

1. 96 oyuklu hücre dışı akı hücre kültürü plakasında tohum CVE hücreleri (bEnd.3 hücreleri): 80 μL/oyuk. Hücre kültürü plakasını 37 °C'de %5 CO₂ inkübatöre yerleştirin. Not: Oyuk başına 16 × 10³ hücre, 24 saat içinde% 60 - 80 birleşmeye ulaşacaktır.
2. Hücreler bir kimyasala maruz kalıyorsa, hücreler plaka tabanına bağlandıktan sonra (tohumlamadan 8-24 saat sonra) tedavileri ekleyin.
   not: Transfeksiyon deneyleri için, tam bir büyüme ortamına antibiyotik eklemeyin.

2. Biyoanalizör Kullanılarak Mitokondriyal Fonksiyonun Değerlendirilmesi

1. Testin başlamasından önce, plakaya 150 μL hücre dışı akı kalibranı çözeltisi ekleyerek ve gece boyunca CO₂ olmadan 37 ° C'de inkübe ederek bir hücre dışı akı sensörü kartuşunu kalibrantlı hidratlayın.
2. Plaka yıkama istasyonunu kullanarak, hücre kültürü ortamını pH 7.0 hücre dışı akı test ortamına değiştirin. Hücreleri CO₂ olmadan 37 ° C'de 30 - 60 dakika inkübe edin.
3. Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda (DMEM) 8 μM oligomisin, 4.5 μM Karbonilsiyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP), 10 μM rotenon ve 10 μM antimisin A'nın çalışma solüsyonlarını hazırlayın. 25 μL stok çözeltilerini kartuş enjeksiyon portlarına yükleyin: Port A, oligomisin; Bağlantı Noktası B, FCCP; Port C, rotenon ve hücre dışı akı tahlil ortamı ile antimisin A. Test protokolünü Tablo 1'de açıklandığı gibi uygulayın.
4. Hidratlı kartuşu biyoanalizöre yükleyin ve "Başlat" düğmesine tıklayarak kalibrasyonu gerçekleştirin. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, kartuş alt plakasını çıkarın ve "Kartuşu Boşalt" istemine tıklayarak hücre plakasını yükleyin. Tüm ölçümler tamamlanana kadar teste devam edin.
5. Veri dosyasını açın ve biyoanalizörden oran değerlerini alın. Verileri bir elektronik tablo dosyasına aktarın.

Tablo 1. Alet çalıştırma protokolü.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
bEnd.3 hücre satırı	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2299	25-30 pasaj
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	ATCC (Uzay Servisi)	30-2002
Fetal sığır serumu	Atlanta Biyoloji	S12450 Serisi	Finalde %10
Penisilin / Steptomisin	Klon	SV30010	1×100 çorap
% 0.25 tripsin% 0.03 EDTA çözeltisi	Corning	25-053-CI
Sodyum piruvat	Corning	25-000-CI	Finalde 1.0 μM
glikoz	Sigma	CAS 50-99-7	Finalde 25 mM
Oligomisin	Sigma	O4876	Finalde 1.0 μM
Karbonilsiyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)	Sigma	C2920	Finalde 0,5 μM
Rotenon	Sigma	R8875 Serisi	Finalde 1.0 μM
Antimisin A	Sigma	CAS 1397-94-0	Finalde 1.0 μM
Plaka yıkama istasyonu	Denizatı Biyobilimi
Hücre dışı akı biyoanalizörü	Denizatı Biyobilimi	XFe96
Hücre dışı akı hücre kültürü plakası	Denizatı Biyobilimi	102416-100
Hücre dışı akı sensörü kartuşu	Denizatı Biyobilimi	102416-100
Hücre dışı akı kalibrant çözeltisi	Denizatı Biyobilimi	100840-000
Hücre dışı akı tahlil ortamı	Denizatı Biyobilimi	102365-100	Testten önce tamponlanmış PH

Serisi Serisi Serisi Serisi