Bir Ex Vivo Fare Jejunum Segmentinde Mezenterik Afferent Sinir Aktivitesinin Kaydedilmesi

Özet

Kaynak: Nullens, S., et al. Fare Jejunal ve Kolonik Segmentlerinde Mezenterik Afferent Sinir Aktivitesinin İn Vitro Kaydı. (2016).

Bu video, doku basıncının ve hareket değişikliklerinin afferent sinir aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için diseke edilmiş bir fare jejunal segmentindeki mezenterik afferent sinirlerden gelen elektrik sinyallerinin kaydedilmesi sürecini göstermektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Jejunal afferent sinirin hazırlanması

1. Deneyden önce yerel Etik Komite tarafından onaylanmış ergen veya yetişkin kemirgenin kemirgen ötenazisini gerçekleştirin (ör., terminal sedasyon ve ardından kardiyak ponksiyon, servikal çıkık vb.).
   not: Hayvanları kurban etmek için servikal çıkık kullandık, böylece dokular in vitro olarak daha fazla işlendiği için daha fazla anestezi veya cerrahi sonrası bakıma ihtiyaç duymadan deneylerle sonuçlandı.
   not: Yaşın mezenterik afferent mekanosensoriyel fonksiyonları zayıflattığı gösterilmiştir, bu nedenle araştırmacılara tek bir deney süresince belirli bir yaş grubuna uymalarını tavsiye ediyoruz.
2. Kurban edilen laboratuvar hayvanını sırtüstü pozisyona getirin ve ksifoid sürecinden kasık kemiğine kadar uzanan bir neşter kullanarak deri ve karın kas tabakası boyunca bir karın orta hat kesisi yapın.
3. Karın içi dokuların kurumasını önlemek için karın boşluğunu soğuk Krebs solüsyonu ile yıkayın (Krebs bileşimi: 120.03 mM NaCl, 6.22 mM KCl, 1.57 mM NaH₂PO₄, 15.43 mM NaHCO₃, 1.21 mM MgSO₄, 11.52 mM D-glikoz ve 1.52 mM CaCl₂).
4. Duodenojejunal fleksuranın hemen distalinden başlayarak ince bağırsağın yaklaşık 20 cm'lik kısmını eksize ederek, çevredeki yapılara zarar vermemeye dikkat ederek ve jejunal kan damarları ve afferent sinirleri içeren bağırsak mezenterini sağlam tutarak keskin bir makas kullanarak tüm jejunumu hızla eksize edin.
   not: Karın boşluğundaki sadece jejunal diseksiyon için, çıplak gözle kolayca görüntülenebildiği için stereomikroskop kullanılmasına gerek yoktur.
5. Eksize edilen jejunumu buz gibi soğuk bir Krebs solüsyonuna yerleştirin ve Krebs solüsyonunu sürekli olarak karbojen (%95 O₂,% 5 CO₂) ile oksijenlendirirken buz üzerinde tutun.
6. Jejunumu keskin bir makasla yaklaşık 3 cm uzunluğunda ilmekler halinde kesin. Damarları ve splanknik siniri içeren mezenterik demeti, ilgili döngünün merkezine yakın bir yerde gözlemleyin.
7. Luminal içeriği ve kekiği çıkarmak için künt bir kateter kullanarak her bir segmenti Krebs solüsyonu ile yıkayın, çünkü bunlar doku örneğinin in vitro olarak bozulmasını hızlandıracak sindirim enzimleri içerir.
   not: Yıkama sırasında döngünün lümenine zarar vermemeye dikkat edin, çünkü villusun tahrip olması, afferent sinir aktivitesini değiştirebilecek aracıların salınmasına neden olacaktır.
8. Afferent sinir aktivitesini ölçmek için segmenti tanımlayın (örneğin, Treitz ligamentinin distal ilk jejunal segmenti veya duodenojejunal fleksura) ve bunu bir silikon elastomer tabaka ile kaplanmış amaca yönelik bir kayıt odasına yerleştirin.
   not: Jejunumun başlangıcı anatomik olarak ince bağırsağın Treitz ligamentinin ince bağırsağı geçtiği kısım olarak tanımlanır ve aynı zamanda duodenojejunal fleksür olarak da adlandırılır.
   not: Deneyin başlamasından çok önce kayıt odasının altını ince bir silikon elastomer tabaka ile kaplayın. Bu elastomer tabakayı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
9. Hazneyi sürekli olarak 10 ml/dk hızında ılık, karbonjene Krebs çözeltisi ile perfüze edin ve kayıt odasındaki Krebs sıcaklığını 34 °C'de sabit tutun.
10. Jejunal segmenti organ banyosuna monte edin, böylece oral uç lümen akışı sağlayan şırınga sürücüsüne bağlanır ve aboral uç dışarı akışa bağlanır. Segmenti hafifçe gerin, ancak aşırı gerginlik uygulamamaya dikkat edin. Her iki ucu da 4/0 ipek ligatür kullanarak giriş ve çıkış portlarına sıkıca takın.
11. Şırınga sürücüsünü oral uca takın ve jejunal segmenti intraluminal olarak Krebs solüsyonu (oksijensiz, ortam sıcaklığı) ile 10 ml / saat hızında perfüze edin.
12. Monte edilmiş bağırsak segmentinin mezenterini silikon elastomer alt tabakaya düz bir şekilde sabitlemek için böcek pimleri kullanın. Mezenterik demetin görselleştirilmesini optimize etmek için mezenteri uzatın; Demet veya jejunum üzerinde zorlama uygulamayın.
13. Bir test rampası distansiyonu gerçekleştirin (vide infra) monte edilen segmentten intraluminal Krebs çözeltisinin sızmadığını doğrulamak için bağırsak segmentinin intraluminal basıncı 60 mmHg'ye ulaşana kadar çıkış portunu kapatarak. Kesintisiz olarak intraluminal basınçta yumuşak bir artış gözlemleyin.
14. İlk distansiyon fazı sırasında segmentin küçük kasılmalarını (peristaltik dalgalar) gözlemleyin. Gerekirse, Krebs çözeltisine 1 μM L tipi kalsiyum kanal blokeri nifedipin ekleyerek peristaltik aktiviteyi bloke edin.
    not: Nifedipine ek olarak Krebs çözeltisine 1 μM atropin eklenmesi bağırsak segmentini tamamen felç edecektir.
15. Stereomikroskop altında, yağ dokusu içinde gömülü olarak bulunan damarlara ve afferent sinire zarar vermemeye özen göstererek, iki küçük cımbızla hafifçe çekerek mezenterden yağ dokusunu nazikçe soymaya başlayın.
16. Jejunumdan uzak bir mesafeden başlayın ve mezenterik demetteki her iki kan damarını da açığa çıkarın.
17. Her iki damar arasındaki afferent jejunal siniri, yağ dokusu içinde kapsüllenmiş ince, beyaz bir iplik olarak gözlemleyin. Sadece hem mezenterik damarların hem de afferent sinirin ilk tanımlanması zor olduğunda, cımbız kullanarak yağ dokusunu nazikçe soyarak jejunuma doğru daha proksimal diseksiyon yapın.
18. Sinire yapışan yağ dokusunu çıkararak, segmentin jejunal mezenterik sinirini birkaç milimetrelik bir mesafe boyunca serbest olarak inceleyin.
19. Keskin doku makası kullanarak siniri kesin. Gerekirse, kalan yağ ve bağ dokusunun yanı sıra epinöronal kılıfı küçük cımbızla hafifçe çekerek soyun.
20. Bir mikromanipülatör kullanarak, bir pistonlu bir şırıngaya bağlı olan emme elektrodunun ucunu organ banyosuna indirin; daha sonra, pistonu manipüle ederek, organ banyosundan bir miktar Krebs solüsyonunu nazikçe aspire edin, böylece elektrotun ucu Krebs solüsyonuna batırılır (Şekil 1). Krebs solüsyonunun emme elektrodunun içindeki tel elektrodu kapladığından emin olun.
    not: Deney başlamadan önce tel elektrodu içeren borosilikat cam emme kılcal damarını hazırlamak için bir pipet çektirmesi kullanın.
21. Emme elektrodunun ucunu kesilen afferent sinir zincirinin hemen yanına yerleştirin ve kesilen sinir zincirini tüm uzunluğu boyunca kılcal damara çekin.
22. Elektrotun ucunu bir miktar yağ dokusuna doğru manevra yapın ve bunu piston ile sıkıca aspire ederken cam kılcal damara aspire edin, böylece kılcal damardaki siniri organ banyosunun içeriğinden mekanik olarak 'sızdırmaz hale getirin'.
23. Veri toplama sistemini kullanarak afferent sinir aktivitesinin kaydını doğrulayın, örneğin, afferent ateşlemede rampa distansiyonunun neden olduğu bir artış gerçekleştirerek (vide infra). Sinirin emme elektroduna izole edilmesinin ardından, gerçek deneyleri gerçekleştirmeden önce spontan afferent sinir aktivitesinin sabit bir durumunu elde etmek için hazırlığı 15 dakika boyunca stabilize edin.
24. Rampa şişirme işlemini gerçekleştirmek için, çıkış portunu kapatarak bağırsak segmentini şişirin, bu da basınçta kademeli bir artışa (60 mmHg'ye kadar) yol açar. İstenen deneysel protokolü, yalnızca art arda üç rampa distansiyonu (15 dakikalık aralıklarla) tekrarlanabilir çok üniteli bir deşarj sağladığında gerçekleştirin (Şekil 2).

Sonuçlar

Şekil 1: Amaca Yönelik Kayıt Odası ve Emme Elektroduna Şematik Genel Bakış. Emme elektrodu ve kayıt odası yerindeyken teknik kuruluma ayrıntılı genel bakış.

Şekil 2: Jejunal afferent sinir aktivitesinin in vitro kaydının temsili izlemesi. Başlangıçta ve ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum klorür (NaCl)	VWR Kimyasalları	2,78,10,295	bileşik Krebs çözeltisi
Potasyum klorür (KCl)	Acros organikleri	196770010	bileşik Krebs çözeltisi
Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2PO4)	VWR Kimyasalları	1,06,34,61,000	bileşik Krebs çözeltisi
Sodyum bikarbonat (NaHCO3)	Merck	1,06,32,91,000	bileşik Krebs çözeltisi
Magnezyum sülfat (MgSO4)	Merck	1,05,88,61,000	bileşik Krebs çözeltisi
Kalsiyum klorür (CaCl2)	Merck	2,38,11,000	bileşik Krebs çözeltisi
D-glikoz	VWR Kimyasalları	1011175P	bileşik Krebs çözeltisi
Damıtılmış su			bileşik Krebs çözeltisi
PVC boru	Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri		Bağırsak segmenti PVC boru üzerine monte edilmelidir
Silikon boru	Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri		Borunun geri kalanı, ideal olarak silikon bazlı - borudaki kalıntıların daha kolay yerinden çıkması
İpek iplik	Armut Sınırlı	10B15S220	Segmentin PVC boru üzerine takılması
Şırınga sürücüsü	Harvard Aygıtı	55-2222	Krebs'in intraluminal infüzyonu
Dürbün - oculair'de 10x büyütme dahil	Zeiss STEMI 2000		Afferent sinirin diseksiyonu için en uygun görselleştirme
Homeotermik Battaniye Kontrol Ünitesi	Harvard Aygıtı	507214	Organ odasının ısıtılması
Sylgard kaplı alt kısım ile özel yapım organ banyosu
Spike2 yazılımı			Verilerin kaydedilmesi ve analizi
Böcek pimleri, 500 adet, paslanmaz çelik, çap 0,2 mm	Austerlitz böcek iğneleri minutiens		Afferent sinirin diseksiyonu
Cımbız Dumont #5 inox 11cm	Dünya Hassas Enstrüman	500341	Afferent sinirin diseksiyonu
Makas, yay, 14 cm	Dünya Hassas Enstrüman	15905	Afferent sinirin diseksiyonu
DB dijital zamanlayıcı	NL 108T2/10		basınç dönüştürücü
Mikromanipülatör	Narishige (Narishig)	M-3333	Emme elektrodunun 3D manipülasyonu
Mikromanipülatör	X-4 döner blok		Emme elektrodunun 3D manipülasyonu
Mikromanipülatör	GJ-8 manyetik stand		Emme elektrodunun 3D manipülasyonu
Işık Kaynağı	Euromex Mikroskoplar Hollanda EK-1		Afferent sinirin diseksiyonu için en uygun görselleştirme
CED 1401 Kayıt Aparatı			Afferent sinir aktivitesinin kaydedilmesi
Humbug 50/60Hz Gürültü Giderici	Quest Bilimsel Aletler		Arka plan gürültüsünün ortadan kaldırılması
İnfüzyon Pompası	Gibson Minipuls 2		Segmentin monte edildiği organ odasının infüzyonu
Mikroelektrot Tutucu Yarım Hücreler 1,5 mm	Dünya Hassas Enstrüman	MEH2SW	Afferent elyafın izolasyonu için emme elektrodu
Borosilikat cam kılcal damarlar, 300 adet; 1.5 / 0.84 OD / ID	Dünya Hassas Enstrüman	1B150-4	Afferent sinirin izolasyonu için kılcal

Serisi Serisi Serisi damar