$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Çözelti Hazırlama
- Hücre dışı çözelti hazırlayın S1: 4- (2-Hidroksi-etil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) (mM cinsinden) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES içeren tamponlu hücre dışı çözelti; pH = 7.3 (NaOH ile ayarlanır); ozmolarite = 300 mOsm (glikoz ile ayarlanır).
- Hücre dışı çözelti hazırlayın S2: 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgS04, 5 bis (2-hidroksietil)-2-aminoetansülfonik asit (BES); pH = 7.3; ozmolarite = 300 mOsm (glikoz ile ayarlanır).
- Doku gömmek için %4 düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz çözeltisi (S3) hazırlayın: %4 düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz. 2 g düşük jelleşen agarozu 100 ml'lik bir cam laboratuvar şişesinde 50 ml S1 içinde manyetik bir karıştırıcı ile birlikte çözün. Agarozu eritmek için, şişeyi yaklaşık 20 dakika veya karıştırırken çözelti şeffaf hale gelene kadar 70 ° C'de bir su banyosuna (kapak sıkıca kapatılmamışken) koyun. Soğutun ve erimiş agarozu daha fazla kullanana kadar 42 ° C'de ikinci bir su banyosunda tutun.
- Hücre içi çözelti S4'ü hazırlayın: (mM cinsinden) 143 KCl, 2 KOH, 1 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 0.3 CaCl2 (serbest Ca2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 adenosin 5'-trifosfat magnezyum tuzu (MgATP), 1 guanozin 5'-trifosfat sodyum tuzu (NaGTP); pH = 7.1 (KOH ile ayarlanır); ozmolarite = 290 mOsm.
- S1, S 2 ve S4'ün bileşimini bireysel deneysel tasarıma göre değiştirin / ayarlayın (örneğin, belirli voltajla etkinleştirilen akım türlerini izole etmek için farmakolojik blokerler).
>2. VNO Diseksiyonu ve Gömme
- CO2'ye kısa süre maruz bırakarak hayvanı kurban edin ve keskin cerrahi makas kullanarak başını kesin. Not: Hayvanın kurban edilmesinden VNO kapsülünün buza konulmasına kadar geçen süre kritik olduğundan, süreyi 2 dakikadan daha kısa bir süreye düşürün. Doku canlılığını korumak için, her iki tamamen diseke VNO'yu 30 dakikadan daha kısa bir sürede agaroza gömün.
- Alt çeneyi büyük cerrahi makasla çıkarın. Ağız boşluğundan girin ve her iki tarafın mandibula kemiklerini ve kaslarını ayrı ayrı kesin.
- Başın kalan kısmını büyük Petri kabına baş aşağı yerleştirin.
Kesici dişlere - daha iyi erişim sağlamak için üst çenenin derisini ve burun ucunun çevresini orta forseps ile çekin.
- Kesici dişlerin en büyük kısmını rostral yönde ~45° açıyla kesmek için kemik makası kullanın (Şekil 1A). Bu, VNO kapsülünün burun boşluğundan çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.
not: VNO kapsülünün ucunun zarar görmesini önlemek için dişin köküne kadar kesmeyin.
- Sert üst damağı orta forseps ile rostral kısmından tutun ve düz bir açıyla tek parça halinde dikkatlice soyun (Şekil 1B).
not: Buz gibi soğuk S2 ile tekrar tekrar durulayın.
- Vomer kemiğinin ucu ile çene arasındaki kemik füzyonunu kesmek için mikro yaylı makas kullanın. Makas uçlarını, ucun kavisli kısmı VNO'dan dışa bakacak şekilde yerleştirin ve kemiği VNO kapsülünün yanında hem sol hem de sağ tarafta küçük adımlarla dikkatlice kesin.
- VNO kapsülünü çıkarmak için, kaudal kısımdaki vomer kemiğini kesmek için mikro yaylı makas kullanın ve orta forseps kullanarak vomer kemiğini burun boşluğundan dikkatlice kaldırın. VNO'yu hemen diseksiyonun kalan adımlarının gerçekleştirileceği bir buz jeli paketi üzerinde stereo mikroskop altında küçük bir petri kabına aktarın.
- Dokunun kurumasını önlemek için VNO'yu az miktarda buz gibi soğuk S2 ile durulayın.
- VNO yumuşak dokularını içeren kıkırdaklı kapsülleri, vomer kemiğinin arkasını orta forseps ile tutarak ayırın. Kapsülü, her iki VNO arasındaki bir bölünme görünür hale gelecek şekilde dorsal bir görünüm için konumlandırın (Şekil 1Di).
- Vomer kemiğini arka kısımda sabit tutarken her iki kıkırdak VNO kapsülünü merkezi kemikten ayırmak için ince forsepsin ucunu kullanın.
not: Forsepsleri sadece kıkırdak kapsülünün kenarında kullanın ve hassas duyusal epitel kolayca zarar görebileceğinden kıkırdağı delmemeye çok dikkat edin.
- İki VNO ayrıldıktan sonra, ilk VNO'yu kapsülleyen kıkırdağı çıkarmaya başlayın.
- Kapsülün üst kenarını ince bir forseps ile tutun ve daha önce vomer kemiğine (medial taraf) bağlı olan kıkırdak duvarını ayırın.
- Kalan kıkırdağı çıkarmak için, VNO'yu kavisli yan tarafı ile tabağın dibine çevirin ve forseps kullanarak bir taraftaki kıkırdağı güvenli bir şekilde sabitleyin. Doku ve kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için ikinci ince forsepsleri arka taraftan kıkırdak ve VNO arasında çok düz bir açıyla dikkatlice hareket ettirin.
- Duyusal epitele zarar vermemek için VNO'yu kaudal ucundan tutarak kıkırdaktan yavaşça soyun.
- VNO kapsülden çıkarıldıktan sonra, kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını çıkardığınızdan emin olun, çünkü kalan kıkırdak parçaları dilimleme işlemi sırasında dokuyu çevredeki agarozdan ayıracaktır.
- Doku hasarını önlemek için ilk diseke edilen VNO'ya küçük bir damla buz gibi soğuk S2 damlatın. Lateral tarafta büyük bir kan damarı görünür hale gelecektir, bu da organın hala sağlam olduğunu ve diseksiyon sırasında büyük ölçüde hasar görmediğini gösterir (Şekil 2Aii). Kan damarının hasar görmesi durumunda, genel morfoloji açıkça bozulmadığı sürece VNO'yu dilimlemeye devam etmek yine de faydalı olacaktır.
- Hemen ikinci VNO'yu inceleyin.
- VNO'ları gömmek için, her iki küçük petri kabını kenara kadar eritilmiş S3 ile doldurun (42 ° C'de su banyosunda saklanır; bkz. 1.3).
- Duyusal epitele zarar vermemek için VNO'yu ince forseps ile daha geniş kaudal uçta tutun.
- VNO'yu agarozun içine daldırın ve hücre dışı çözelti filmini ve yüzeyindeki hava kabarcıklarını çıkarmak için birkaç kez yatay olarak ileri geri hareket ettirin.
- VNO'yu kuyruk ucu tabağın dibine bakacak şekilde dikey olarak konumlandırın. VNO'yu doğrudan forseps ile sıkıştırmak yerine, forseps ucunu VNO'ya yakın hareket ettirerek yönü ayarlayın.
not: Gömme sırasındaki oryantasyon, deney sırasında dilim düzlemini ve duyusal nöronlara erişilebilirliği belirlediği için çok önemlidir.
- Bulaşıkları jel buz torbasının üzerine koyun ve agaroz katılaşana kadar bekleyin.
Not: Agaroz katılaşmaya başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin, çünkü bu, dokuyu çevredeki agarozdan ayıracaktır.
>3. Koronal VNO Doku Dilimleme
- Agaroz bloğunu küçük tabaktan büyük bir Petri kabının kapağına çıkarmak için küçük bir spatula kullanın, agarozu VNO'nun kaudal ucunu yukarı bakacak şekilde ters çevirin.
- Cerrahi bir neşter kullanarak bloğu piramidal bir şekle kesin (uçta 3-4 mm, altta 8-10 mm). Gömülü dokuya zarar vermemeye dikkat edin.
- Piramit şeklindeki bloğu vibratom numune plakasının merkezine sabitlemek için süper yapıştırıcı kullanın ve yapıştırıcının tamamen kuruması için ~ 1 dakika bekleyin.
- Numune plakasını dilimleme odasına aktarın ve buna göre ikinci VNO'yu hazırlayın. Plakayı ikinci numuneyle birlikte kullanana kadar 4 °C'de tutun.
- Aşağıdaki ayarlara sahip titreşimli bir bıçak mikrotomu kullanın: kalınlık: 150-200 μm; hız: 3.5 a.u. = 0.15 mm/sn; frekans: 7.5 a.u. = 75 Hz. Diseksiyon mikroskobu altında kesit morfolojisini kısaca inceledikten sonra dilimleri kullanıma kadar oksijenleme odasına aktarın. Dilimler birkaç saat saklanabilir.
4. Tek Hücreli Elektrofizyolojik Kayıtlar
- Kayıtlar için, suya daldırma objektifleri, Dodt veya kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) ve epifloresan ile donatılmış dik sabit aşamalı bir mikroskop ve ayrıca soğutmalı şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera kullanın. Veri toplama için bir yama kelepçesi amplifikatörü, kafa aşaması, analogdan dijitale / dijitalden analoğa (AD/DA) arayüz kartı ve bir bilgisayar (kayıt yazılımı dahil) kullanın.
- 10-20 yama pipeti (4-7 MΩ) stoğu hazırlayın. Borosilikat cam kılcal damarlardan (1,50 mm dış çap [OD]/0,86 mm iç çap [ID]) pipetleri bir mikropipet çektirme kullanarak çekin ve bir microforge ile ateş parlatın.
not: Pipet uçlarının ateşle parlatılması, oldukça küçük VSN'lere yama yapılırken çok önemlidir. Bu, yüksek dirençli bir sızdırmazlık elde etmek için negatif basınç uygularken hücre zarının yırtılmasını önlemeye yardımcı olacaktır. Parlatma işleminden sonra pipet açıklığı yaklaşık 1 μm olmalıdır.
- Kullanana kadar hasar ve toz birikmesini önlemek için pipetleri bir pipet saklama kavanozunda saklayın.
- Çözelti rezervuarlarını ve hortumları deneysel tasarıma göre doldurarak perfüzyon sistemini hazırlayın.
not: Elektrofizyolojik kayıtlara güçlü bir şekilde müdahale edeceği için hava kabarcıklarını borudan tamamen çıkarın.
- ~ 3 ml / dak akış elde etmek için basıncı ayarlayın.
not: Yüksek basınçlar doku diliminin hareketine ve elektrofizyolojik kayıtların sona ermesine neden olacaktır.
- VNO dilimini görüntüleme odasına aktarın ve 0,1 mm kalınlığında sentetik elyaflarla bağlanmış paslanmaz çelik ankraj kullanarak dilim konumunu sabitleyin (Şekil 2B-C).
not: Doku dilimini sentetik elyaf ipliklerinden biriyle örtmeyin, bunun yerine dilimi çevreleyen agarozla örtün.
- Görüntüleme odasını kayıt düzeneğine aktarın ve bir banyo uygulaması ile oda sıcaklığında oksijenli S2 ile dilimi sürekli olarak birleştirin.
- Banyo çözeltisinin sürekli değişimi için yavaş bir emme oluşturmak için emme kılcal damarını çözeltinin yüzeyine ayarlayın. 8'i 1 arada çok namlulu "perfüzyon kalemini" kan damarını içeren VNO diliminin duyusal olmayan kısmının üstüne ve yakınına ayarlayın (Şekil 2C, 3A). Perfüzyon kalemi ve kayıt pipetinin dilime zıt yönlerden bakacak şekilde düzenlenmesi faydalı olacaktır.
- L şeklinde bir agar köprüsü (150 mM KCl ile doldurulmuş) kullanarak referans elektrodu ve banyo solüsyonunu bağlayın.
- Yama pipetini pipet çözeltisi S4 ile doldurun.
- Pipeti, kaplamayı kazımadan kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı yama elektrodunun üzerine monte edin ve sıkıca takın.
- Banyoya girmeden önce yama pipetine hafif pozitif basınç (10 ml'lik plastik şırıngada yaklaşık 1 ml) uygulayın.
- Hedefi çarpmadan suya daldırabilecek kadar mikro manipülatörler kullanarak pipeti banyoya indirin (Şekil 2D).
- Kafa aşamasına bağlı elektrofizyoloji yazılımını kullanarak pipet direncini (Rpip, 4-7 MΩ arasında) izleyin.
not: Rpip <4 MΩ ise cam ucu kırılır. R pip >10 MΩ ise, uç büyük olasılıkla tıkalıdır ve pipetin değiştirilmesi gerekir.
- Kızılötesi optimize edilmiş diferansiyel girişim kontrastı (DIC) kullanarak bir CCD kamera ile VNO dilimini görselleştirin ve floresan aydınlatma ve uygun bir filtre küpü kullanarak hücreleri (veya benzer şekilde etiketlenmiş nöronları) ifade eden FPR-rs3-i-Venüs'ü (FPR-rs3: formil peptit reseptörü ile ilgili dizi 3) tanımlayın.
- Deneysel tasarıma bağlı olarak floresan veya floresan olmayan hücrelere odaklanın ve hedefleyin.
- Hücre gövdesine yaklaşmak için, maksimum hassasiyet için el çarklarını kullanın. Pozitif basınç nedeniyle, pipet ucu yakına geldiğinde hücre soma zarındaki küçük bir çukur görünür hale gelir.
- Pozitif basıncı serbest bırakın ve yüksek dirençli bir sızdırmazlık (1-20 GΩ) elde etmek için hücre zarını emmek için hafif negatif basınç uygulayın. Hücre zarını bozmak ve tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için kısa ve yumuşak emme uygulayın.
- Deney sırasında erişim direncini sürekli izleyin.
not: Yalnızca küçük ve kararlı erişim direnci (Rgirişinin %≤3'ü; deney boyunca değişim
