Nöbet İndükleyici Ajanlara Yanıt Olarak Beyin Korteksinin Çok Elektrotlu Bir Dizi ile İzlenmesi

Özet

Kaynak: Lu, HC, et al. Farelerin beyin dilimi hazırlığında nöbet benzeri aktivitenin doğru akım stimülasyonu ve çoklu elektrot dizisi kaydı. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, transkraniyal doğru akım stimülasyonunun (tDCS) anterior singulat korteks (ACC) ve talamus bölgelerini içeren beyin dilimleri üzerindeki etkileri, elektrik sinyallerini ölçmek için çok elektrotlu bir dizi (MEA) kullanılarak araştırılmaktadır. Çalışma, elektrik darbeleri vererek ve nöbete neden olan ilaçları infüze ederek, nöbetlere ACC yanıtını araştırır.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. MEA (Çok Elektrotlu Dizi) Kaydı için Deneysel Çözelti ve Ekipman Hazırlama

1. Yapay beyin omurilik sıvısı hazırlayın (aCSF; 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₃, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO3 ve 10 mM glikoz,% 95_O2 ve% 5 CO₂ ile köpürtülmüş).
2. İki tür MEA probu kullanın: 6 x 10 düzlemsel MEA ve 8 x 8 MEA. Eski prob korteks, striatum ve talamusu içeren bölgeyi kapsar. İkinci prob sadece kortikal bölgeyi kapsar.
3. 60 amplifikasyonda 0.1 Hz ile 3 kHz arasında ayarlanmış bant geçiren filtreye sahip 1,200 kanallı bir amplifikatör kullanın. 10 kHz örnekleme hızında veri alın.
4. DCS (Doğru akım stimülasyonu) için MEA haznesinin içine iki AgCl kaplı gümüş tel yerleştirin. Ardından, izole edilmiş bir stimülatör tarafından üretilen elektrik alanlarını üretmek için AgCl kaplı gümüş telleri kullanın.
5. Talamik stimülasyon için bir tungsten elektrot (çap, 127 μm; uzunluk, 7.62 cm; 8 ° AC konik uç; direnç, 5 MΩ) yerleştirin ve referans elektrodu MEA odasına yerleştirin. Tungsten elektrotun akımlarını, bir darbe üreteci tarafından kontrol edilen izole bir stimülatör kullanarak verin (Şekil 1).

2. Beyin Dilimi Hazırlama

1. 4-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanın. Hayvanları klimalı bir odada (21-23 °C; %50 nem; 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, ışıklar 08:00'de açık) yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan bir yerde barındırın.
2. Adım 1.1'de hazırlanan aCSF'den 250 ml'lik bir alikot alın ve buz dolu bir behere yerleştirin. Aynı zamanda, %95_O2 ve %5 CO_2'den oluşan sürekli gaz sağlayın.
3. ameliyat
   1. Hayvanı yaklaşık 3 dakika boyunca bir cam kutuda% 4 izofluran ile uyuşturun. Hayvan cerrahi bir anestezi derinliğine ulaştığında (ayak parmağının sıkışmasına yanıt verilmemesi ile gösterilir), kırılmış buzla doldurulmuş sığ bir tepsiye yerleştirin ve makas kullanarak kafayı çıkarın.
   2. Kafatasını açığa çıkarın ve kalan kası kesin. Daha sonra, rongeurs kullanarak, kafatasının dorsal yüzeyini beyinden soyun. Rongeurs kullanarak kafatasının kenarlarını kesin. Tüm cerrahi aletleri% 75 etanol çözeltisi ile sterilize edin.
   3. Bir spatula kullanarak, beynin ventral yüzeyi boyunca koku soğancıklarını ve sinir bağlantılarını kesin ve beyni çıkarın. Dekapitasyondan sonra beyni hızlı bir şekilde buz gibi oksijenli aCSF ile doldurulmuş bir behere aktarın.
4. Medial Talamus (MT)-ACC (Anterior singulat korteks) Beyin Dilimi
   Hazırlanması not: MT'den ACC'ye giden yolu içeren dilimler hazırlayın
   1. Subkortikal anatomiyi görüntülemek için beyin bloğunu her yarım kürede orta çizginin 2.0 mm lateralinde iki sagital kesi ile elle kesin. Ardından, iki açılı kesim yapın. Striatumdaki görünür lif yoluna paralel olarak ilk çapraz kesimi yapın.
   2. Beyincik ve görsel korteks arasındaki bağlantıdan, ventral ve talamosinkülat yoluna paralel olan ön komissür ve optik yol arasındaki orta noktaya kadar ikinci çapraz kesimi yapın.
   3. Beyin bloğunu siyanoakrilat yapıştırıcı ile köşeli bir plakaya (~ 120 °) takın ve yolun dönüş noktasının hemen üzerinde bir kesim yapın. Plakayı açın, düzleştirin ve bir vibratomun hazne aşamasına yapıştırın.
   4. Medial talamus-ACC beyin dilimleri (500 μm kalınlığında) yapın ve ardından buz gibi soğuk oksijenli aCSF'ye daldırın.Dilimleri kayıt odasına aktarın ve 1 saat boyunca oksijenli aCSF ile sürekli perfüzyon (12 ml / dak) altında 32 ° C'de tutun.

3. Çok Elektrotlu Dizi Kaydı için Perfüzyon Odasının Hazırlanması

1. Perfüzyon Odasının Hazırlanması
   1. Çok kanallı bir sisteme bir MEA probu yerleştirin ve probu peristaltik bir pompaya bağlamak için iki ayrı polietilen tüp kullanın. aCSF'yi MEA odasına yönlendirmek için bir tüp ve aCSF'yi hazneden çıkarmak için diğer tüpü kullanın. Son olarak, preparatı ılık (29-30 ° C) oksijenli aCSF (8 ml / dak) ile sürekli olarak perfüze edin.
2. Beyin dilimini MEA'ya aktarın. Islak bir pamuklu çubuk kullanarak beyin dilimini MEA üzerinde tutun. ACC'nin elektrotların üzerine yönlendirildiğinden emin olmak için beyin dilimini dikkatlice hareket ettirin.
3. Beyin dilimine basmak için dilim ankraj kitleri ve basılı tutmalar kullanın. Bu adım, dilim ve elektrotlar arasında iyi bir elektrik bağlantısı sağlar.

4. DCS ile Elektrik Alanlarının Üretilmesi

Not: Elektrik alan oryantasyonunun tanımı, ACC'deki aksodendritik eksenin yönüne dayanıyordu. Dendrit ve soma kompartmanlarının oryantasyonları Golgi boyaması kullanılarak doğrulandı12.

1. AgCl elektrodunu (anot olarak tanımlanır) ACC'nin proksimaline yerleştirin ve diğer elektrodu (katot olarak tanımlanır) ACC'nin distaline yerleştirin. MEA tarafından iki alan oryantasyonu (ACC aksodendritik liflerine paralel ve dik) tarafından üretilen alan kuvvetini kaydedin ve bir stimülatör kullanarak elektrik alanlarının akımlarını iletin.
2. AgCl elektrotlarının mesafesini (yaklaşık 1,5-2 cm) sabitleyin ve DCS'yi 0,5 ila 2 mA arasında yapmak için stimülatörün akım gücünü ayarlayın.

5. Elektrikle İndüklenen Kortikal Sinaptik Tepkiler

Not: Programlanabilir bir elektriksel uyaran üretecinin dikdörtgen bifazik akım darbeleri ürettiği MT'de elektriksel stimülasyon ile ACC'de sinaptik tepkileri indükleyin.

1. Yukarıdaki Bölüm 3'ü tekrarlayın.
2. MT'ye bir tungsten elektrot yerleştirin ve stimülatörden bipolar tungsten elektrotlar aracılığıyla dilimlerin talamik bölgesine darbeler iletin.
3. Bir ACC yanıtı ortaya çıkaran eşiği belirlemek için çeşitli akım yoğunluklarını kullanın. Burada, ±150 μA'lık bir yoğunluk ve 200 μsn'lik bir süre kullanın, bu da çoğu dilimde ACC'de %80'lik bir maksimum yanıt ortaya çıkardı.
4. Optimum yanıt profillerini elde etmek için tungsten elektrodu MT-ACC dilimindeki talamosinkülat yolu boyunca (MT'den korpus kallozuma) hareket ettirin.
5. 10-20 ACC yanıtı taraması yapın ve MT stimülasyonu tarafından uyarılan tüm ACC'nin otomatik olarak ortalamasını almak için yazılımı kullanın. Sonuç, MT-ACC yolağı ile MT stimülasyonundan indüklenen ACC'deki sinaptik yanıtlardır.

6. Elektrikle İndüklenen Nöbet Benzeri Aktivite

Not: Nöbet benzeri aktivite, 4-aminopiridin (4-AP; 250 μM) ve bikükülin (5 μM) uygulamasıyla indüklenmiştir. Önceki zaman kontrol çalışmaları, ilaç uygulamasından 2-3 saat sonra maksimum ve stabil yanıtların ortaya çıktığını göstermiştir14.

1. Yukarıdaki Bölüm 5'i tekrarlayın.
2. Perfüzyon çözeltisine ilaçlar ekleyin. 4-AP (4-Aminopiridin) (250 μM) ve bikükülin (5 μM) kullanın. İlaçları homojen bir şekilde karıştırın ve 2-3 saat perfüzyona devam edin.
3. Nöbet benzeri aktiviteyi kolaylaştırmak için, perfüzyon pompasını nispeten hızlı bir perfüzyon hızında (8 ml / dak) tutun, bu da bir pH gradyanının birikmesini önlemeye yardımcı olabilir.
4. MT'ye bir tungsten elektrot yerleştirin ve ACC yanıt profillerini elde etmek için elektrik stimülasyonu (150 μA, 200 μsn süre) verin.
5. 10-20 tarama yapın ve yanıtların ortalamasını alın.
6. İlaçları yıkamak için perfüzyon solüsyonunu taze aCSF ile değiştirin. Adım 6.5'i tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Talamosinkülat Kesitinin Hazırlanması ve MEA Kayıt Sistemi Kurulumu. (A) MT-ACC dilim prosedürü (a) Beyni çıkarın ve (b) oksijenli aCSF'yi soğutmak için aktarın. (c) Orta hattan iki parasagital kesi yapın. (d) Beyin bloğunun medial kısmının yandan görünümü. (e) Beyin bloğunun iki açılı ventral kesimini yapın. (f) Beyin bloğunu açılı bir plastik plakaya yapıştırın. (g) Sırttan bir kesi yapın v...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İzofluran	Halokarbon Ürünleri Şirketi	NDC 12164-002-25	%4
aCSF (toplam:1 L):
D (+) - Glikoz	Merck	1.08337.1000	10 milyon
Sodyum hidrojen karbonat	Merck	1.06329.0500	25 milyon
Sodyum klorür	Merck	1.06404.1000	124 milyon
(+) - Sodyum L-askorbat, >=% 98	Sigma	A4034-100G	0.15 g/2 cc
Magnezyum sülfat, susuz, ReagentPlus	Sigma	M7506-500G	2 milyon
Kalsiyum klorür dihidrat	Merck	1.02382.1000	2 milyon
Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat	Merck	1.06346.1000	1 milyon
Potasyum klorür	May & Baker Ltd Dagenham İngiltere	HANIM 7616	4,4 milyon
(+)-Bicuculline	İçindekiler	130	aCSF'de 5 μM
4-Aminopiridin	İçindekiler	940	aCSF'de 250 μM
Vibratom	Vibratom	1000 Serisi	500 μm kalınlığında dilimler halinde blok dilimleme
Çok elektrotlu dizi (MEA) probları: 6 x 10 düzlemsel MEA	Çok Kanallı Sistemler	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	elektrot çapı, 30 μm; elektrot aralığı, 500 μm; empedans, 200 Hz'de 50 kΩ
Çok elektrotlu dizi (MEA) probları: 8 x 8 MEA	Ayanda Biyosistem	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	piramidal şekilli elektrot; çap, 40 μm; uç yüksekliği, 50 μm; elektrot aralığı, 200 μm; empedans, 200 Hz'de 1.000 kΩ
60X amplifikasyonda 0.1 Hz ile 3 KHz arasında ayarlanmış bir bant geçiren filtre ile 1,200 kanallı bir amplifikatör kullanıldı	Çok Kanallı Sistemler	MEA-1060-MÖ
10 KHz örnekleme hızında MC Rack yazılımı	Çok Kanallı Sistemler		Veri toplama ve kaydetme yazılımı
Bir puls üretecinin kontrolü	Çok Kanallı Sistemler	STG 1002
Ankraj kitlerini ve tutucuları dilimleyin	Warner Enstrümanları	SHD-26H/10; WI64-0250
Peristaltik Pompa-minipuls3	Gilsom Belediyesi	MINIPULS3	Perfüzyon hızı : 8 ml/dk
İzole stimülatör	A-M Sistemleri	Tip 2100	±350 μA yoğunluk, 200 μsn süre
Tungsten elektrot	A-M Sistemleri	575300	talamus içine yerleştirilir

adet Sistemleri Serisi Serisi