Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikroiyontoforez için İlaçlar
NOT: Mikroiyontoforez için kullanılan ilaçların suda çözündüğünde elektrik yüküne sahip olması gerekir. İlgilenilen ilacın bu prosedür için uygun olup olmadığını görmek için literatürü kontrol edin. Burada, GABAA reseptörünün bir antagonisti olan gabazin prosedürü açıklanmaktadır.
- Damıtılmış suyu sterilize etmek için 0,2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak süzün ve çözünen madde içermediğinden emin olun. Bu damıtılmış suyu kullanarak ~ 1.000 μl 20 mM gabazin hazırlayın.
- İnce uçlu bir pH elektrodu kullanarak 0,2 μm filtrelenmiş NaOH ile seyreltmenin pH'ını 4'e ayarlayın.
- 100 - 200 μl alikotları -20 ºC'de saklayın. Kayıt gününde buzunu çözün. O gün, hayvan zaptedilmeden önce, esnek bir plastik iğne ile donatılmış 100 μl'lik bir mikroşırınga kullanarak çok namlulu elektrotun varillerini (3 - 5 μl) ilaçlarla doldurun.
2. Cerrahi ve Kafa Direği İmplantasyonu
- 27 ve 30 g ağırlığında iki erkek CBA/J faresinde (Mus musculus) deneyler yapın.
- Ameliyattan önceki günlerde, hayvanlara tutun ve onları alıştırmak için kayıt odasında özgürce keşfetmelerine izin verin. Her biri en az 30 dakika süren günde üç seans gerçekleştirin. Bu onları sakinleştirecek ve kayıtlar sırasında rahat etmelerini sağlayacaktır.
- Kas içine enjekte edilen ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı kullanarak fareyi uyuşturun. Bu doz, hayvanı yaklaşık 1 saat boyunca derinlemesine uyuşturur. Gerektiği gibi başlangıç dozunun üçte biri kadar ek dozlar verin.
- Hayvanı 38 ± 1 ºC'lik bir sıcaklığı korumak için ayarlanmış bir ısıtma battaniyesine yerleştirin ve iki kulak çubuğu ve bir ısırma çubuğu kullanarak hayvanın kafasını stereotaksik bir çerçevede sabitleyin. Kulak çubuklarıyla kulak zarını delmemeye dikkat edin.
- Bir damla oftalmik jel uygulayarak gözleri koruyun.
- Saç derisini makas kullanarak tıraş edin ve cildi dezenfekte etmek için povidon-iyot uygulayın.
- Bir neşter kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için orta hat boyunca bir kesi yapın ve parietali ve oksipital kemiklerin daha rostral kısmını kaplayan periosteuumu geri çekin.
- Kafatasının üzerine yuvarlak ve düz bir taban (5 mm çap) ile hafif bir duralumin kafa direği (ağırlık ~ 0.65 g, uzunluk 30 mm, Şekil 1A) yapıştırın. Baş direğinin ortasına gümüş bir tel yapıştırın ve uçlarını serbest bırakın. Gümüş tel, elektrofizyolojik kayıt için referans elektrot olarak kullanılacaktır.
- Kafatasına ve kafa direğinin tabanına ince bir tabaka ışıkla sertleştirilebilir yapıştırıcı sürün. 10 saniye bekleyin ve baş direğini orta hat boyunca parietal kemiklerin rostral bölgesinin üzerine yerleştirin.
- Işık: Etkili bir yapışma gücü için mavi ışık kaynağı kullanarak yapıştırıcıyı 20 saniye boyunca sertleştirin.
- Elektrikli bir matkap ve küçük bir matkap ucu kullanarak baş direğinin tabanının etrafına ve arkasına üç delik açın.
- Kafatası ile kafa arasında ek temas noktaları olarak hizmet etmek için delinmiş deliklere iki saat vidası (~2 mm uzunluk) yerleştirin.tage. Vidaların tam oturması için 11/2 tur gerekir. Gevşek olmadıklarından emin olmak için vidaları forseps ile test edin.
- Gümüş topraklama kablosunun ucunu üçüncü deliğe sokun ve dura ile temas ettiğinden emin olun. Teli kafatasına bağlamak için küçük bir damla suya dayanıklı siyanoakrilat yapıştırıcı sürün.
- Baş direğinin kafatası ile bağını güçlendirmek için ışıkla sertleşen kompozit uygulayın. Kayıt sırasında erişime izin vermek için lambdanın arkasına uzanmamaya dikkat ederek baş direğinin tabanını, gümüş telin alçak kısmını ve vidaları kapatın. Mavi ışık kaynağı kullanarak kürleyin.
- Boynun arkasındaki kası, kafatasına yerleştirildiği yere yakın bir yere geri çekin. Küçük bir trephine (2,35 mm çapında) kullanarak, inferior colliculus'u (IC) ortaya çıkarmak için lambda sütürünün hemen altına ve orta hattın yanına doğru yuvarlak bir pencere açın. Kenarlıklar gevşediğinde kaplama kemiğini ince cımbızla yukarı çekin. Kanama meydana gelirse, durdurmak için soğuk steril tuzlu su ile durulayın.
- Pencerenin etrafına küçük (~1 mm genişliğinde ve ~1 mm yüksekliğinde) bir duvar yapmak için kompozit kullanın ve ışıkla sertleştirin.
- Açıkta kalan kafatasını ve kası antibiyotik merhem ile örtün. Ardından, IC'nin açıkta kalan yüzeyini steril tuzlu su ile ıslatın ve vazelin ile kaplayın, kayıt penceresinin etrafındaki duvarı yaptıktan sonra oluşan kuyuyu doldurun.
- Analjezik olarak buprenorfini deri altına (0.03 mg / kg, steril salin içinde 1:10 oranında seyreltilmiş) enjekte edin.
- Hayvanı uyanana kadar ısıtma battaniyesinin üzerinde tutun ve kayıt seanslarından önce üç gün boyunca ameliyattan sonra iyileşmesi için barınma kafesine geri koyun. Kafes arkadaşlarının jöleyi temizlemesini ve baş direğinin metal ızgara kapağına temas etmesini önlemek için hayvanları bireysel farenin barınak kafesinde barındırın. Hayvan tek başına barındırıldığında kafese biraz zenginleştirme yerleştirin. Ayrıca, enfeksiyonu önlemek için talaşı günlük olarak değiştirin ve hayvanın düzgün bir şekilde iyileştiğini ve herhangi bir rahatsızlık belirtisi göstermediğini dikkatlice kontrol edin. Ayrıca, açıkta kalan beyni koruyan kayıt penceresinin üzerinde vazelin olup olmadığını kontrol edin.
3. Elektrofizyolojik Kayıt ve Mikroiyontoforez
- İyileştikten sonra, hayvana kayıt ortamına alışması için zaman verin ve başını yaslayın. Fare, vücut boyutuna göre oyulmuş özel yapım yastıklı bir köpük tutucu üzerinde otururken, baş direğini tutucuya sabitleyerek hayvanı alıştırın (Şekil 1B). Bu, farenin hareketlerini sınırlayacak ve sakinliğine katkıda bulunacaktır.
- 10 dakikalık seanslarla başlayın ve süreyi kademeli olarak 120 dakikaya kadar artırın. Seans sırasında hayvanları belirli aralıklarla tatlı sıvılarla (yoğunlaştırılmış süt, suda 30:70 oranında seyreltilmiş) ödüllendirin. Daha sonra, kayıt oturumu sırasında, oturumun başında ve sonunda veya hiçbir nöron izole edilmemişken aynı ödülü verin.
- Hayvan kayıttan önce uyarılırsa, hafif yatıştırıcı asepromazin (2 mg / kg, intraperitoneal) enjekte edin. İlgilendiğiniz nöral sisteme göre, yatıştırıcı sonuçlarınızı etkileyebilir.
- Hayvanın kayıt odasını 5 - 10 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin.
- Hayvanın vücudunu köpük özel yapım yastıklı tutamaya yerleştirin (Şekil 1B).
- Baş direğini stereotaktik çerçeveye bağlı bir tutucuya sabitleyin (Şekil 1C). Bu, hayvana sıvı bir ödül vermek için iyi bir zamandır.
- Hayvanın vücudunu pamuklu bir battaniyeyle örtün ve plastik bir yarım silindir ve yapışkan bant kullanarak gevşek bir şekilde sabitleyin.
- Vazelini kayıt penceresinden çıkarın ve ılık steril tuzlu su ile durulayın.
- Gabazinin nöral aktivitesini ve iyontoforetik uygulamasını kaydedin.
- Çok namlulu elektrodu, bir mikro sürücü tarafından kontrol edilen ve bir mikro manipülatöre bağlı olan tutucusuna yerleştirin.
- Küçük timsah klipsleri kullanarak kayıt yapmak için kabloları bağlayın. Pozitif terminali tungsten elektrodun ucuna ve toprak terminalini duraya temas eden gümüş kabloya bağlayın.
- Her bir namlunun içine kaplanmamış bir gümüş tel yerleştirin, böylece bir ucu çözeltiye temas eder ve diğer ucu erişilebilir olur. Üreticinin talimatlarını izleyerek bu uçları mikroiyontoforez cihazına bağlayın.
- Çok namlulu elektrodu, uç beynin yüzeyine temas edene kadar hareket ettirin. Beyin dokusunun kurumasını önlemek için ılık steril salin uygulayın. Bu noktada, tek birim aktivite ararken ilacın namlu ucundan sızmasını önlemek için bir tutma akımı (gabazin için -10 nA; belirli ilacın literatürünü kontrol edin) uygulayın.
- Tek nöron hücre dışı aktivitesini izole etmek için standart teknikler kullanın. Nöronun frekans tepki alanını (FRA), yani nöron bu seslere duyarlı olduğu için bir yanıtı uyandırabilen frekansların ve yoğunlukların kombinasyonunu elde edin.
- Benzer bir ateşleme hızı ve deseni uyandıran iki frekans (f1 ve f2) seçin. Bu frekansların her birini tuhaf paradigma altında nadir ve tekrarlayan uyaranlar olarak sunun.
not: Kısaca, tuhaf paradigmada, bir frekans (f1), ortaya çıkma olasılığı yüksek olan tekrarlayan uyaran olarak sunulurken, ikincisi (f2), tekrarlayan uyarıcılar arasına rastgele serpiştirilmiş, nadiren meydana gelen sapkın uyarandır. İkinci bir tuhaf dizide, iki uyaranın göreceli olasılıkları tersine çevrilir.
- Akımı pozitif değerlere (10 - 20 nA) kaydırarak gabazini serbest bırakın. FRA'yı tekrar edinin ve gabazin uygulaması altında tuhaf paradigmayı tekrarlayın. Ateşleme hızında gözle görülür bir etki gözlenene kadar fırlatmayı sürdürün; Belirli ilaca, konsantrasyonuna ve ejeksiyon akımının büyüklüğüne bağlı olarak genellikle 5 - 20 dakika sürer. İlacın etkisi altındaki değerleri elde etmek için kayıt protokolünü tekrarlayın.
- Akımı tutma değerlerine geri döndürerek enjeksiyonu durdurun. FRA'nın veya tuhaf paradigmaya verilen yanıtın kontrol değerlerine dönüp dönmediğini izleyerek ilacın etkisinin ortadan kalkmasını bekleyin.
not: Kayıt seansları günde 2 - 3 saat sürebilir ve hayvan herhangi bir rahatsızlık veya mücadele belirtisi gösterirse daha erken sonlandırılmalıdır. Sıvı ödülü verin ve kayıt odasını vazelin ile kaplayın.
