Bir Nöron-Astrosit Ko-Kültüründe Nöronal Ağın Elektrofizyolojik Aktivitesinin Kaydedilmesi

Özet

Kaynak: Taga, A., et al. Bölgesel Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla ALS'yi Modellemek İçin Elektrofizyolojik Bir Platformun Kurulması. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, nöronal ağ aktivitesini kaydetmek için bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmayı göstermektedir. Motor nöronların ve astrositlerin ko-kültürü bir çoklu elektrot dizisi (MEA) plakası üzerinde kurulduktan sonra, nöronal ağın senkron ritmik elektriksel aktivitesi MEA kullanılarak hücre dışı olarak kaydedildi.

Protokol

1. Çok elektrotlu dizi plakalarında MN ve omurilik astrositlerinin birlikte kültürlenmesi

1. Motor nöronları ve astrositleri, aynı gün kullanıma hazır olduklarında ve motor nöronlar için in vitro (DIV) 60 ve astrositler için DIV 90 olarak ayırt edin ve plakalayın.
2. 24 oyuklu plastik plakalarla çalışıyorsanız, MEA plakalarını kaplamadan bir gün önce veya kaplama gününde aşağıdaki gibi kaplayın (Malzeme Tablosu).
3. Poliornitini (PLO) su veya fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 100 μg / mL'ye seyreltin.
   1. Her bir oyuğa 15-20 μL ekleyin (pipet konfor seviyesine bağlı olarak), kuyunun merkezinde elektrotların alanını ve çevresini kaplayan ancak kuyunun tamamını kaplamayan bir damlacık oluşturun.
   2. Pipet ucuyla elektrotlara zarar vermemeye dikkat edin. Her kuyuda aynı yüzey alanının kapsanmasını sağlamak için kuyudan kuyuya hacimle tutarlı olun.
   3. FKÖ'yü 37 °C'de en az 1 saat (tercihen 2 saat) inkübe edin.
      not: Plakalarda yeterli nem yoksa küçük hacimler kurur. Kaplama ve kayıtlar boyunca yeterli nemi sağlamak için kuyuları çevreleyen bölmelere su ekleyin.
4. Plastik bir mikropipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla FKÖ aspire edin. Elektrotlara dokunmamaya dikkat edin. 250 μL su ile üç kez yıkayın. Yıkamalar için vakumlu aspiratör kullanıyorsanız, ucun elektrot dizisine yaklaşmasına izin vermeyin. Üçüncü yıkamadan sonra, gerektiği kadar bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla suyu alın. Yüzeyi, kapağı çıkarılmış olarak hücre kültürü başlığının altında kurumaya bırakın.
5. Plaka yüzeyleri kuruduktan sonra, PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltilmiş laminin ekleyin. Her elektrot dizisini kaplamak için 15-20 μL kullanın. Nem bölmelerine su ekleyin, kapağı yerine takın ve plakayı en az 2 saatten gece boyunca 37 °C inkübasyona geri koyun.
6. Kaplama gününde, motor nöron (MN) ve astrosit kültürlerini PBS ile bir kez durulayın ve hücreleri kaldırmak için 37 ° C'de% 0.05 tripsin ekleyin (5 dakika). Tripsin inhibitörü içeren 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için plakaları orta veya baz ile yıkayın. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve 1 mL tek hücreli süspansiyon oluşturmak için 1000 μL'lik bir pipetle yeniden süspanse edin. MN ve astrositleri yeniden süspanse ederken, 20 μM Rho ile ilişkili sarmal bobin oluşturan protein serin / treonin kinaz inhibitörü (ROCK-I) ilavesiyle ko-kültür ortamına (Tablo 1) geçin.
7. Bir hemositometre kullanarak MN ve astrositleri paralel olarak sayın. Sayarken ve hesaplamalar yaparken, hücre süspansiyonlarını kapatın ve 4 °C'de bir Strafor rafa yerleştirin.
8. Kültürleri motor nöronlar için 5 μL'de 5 x 10⁴ hücre ve astrositler için 5 μL'de 2.5 x 10⁴ hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse etmek için gereken hacmi hesaplayın. 1 mL hücre süspansiyonlarını 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve hesaplanan hacimde yeniden süspanse edin.
9. Tohumlanacak istenen kuyucukların sayısını hesaplayın ve bunu her hücre süspansiyonunun 5 μL'si ile çarpın. Gerekli miktarda nöron ve astrosit süspansiyonunu 1:1 oranında birleştirin ve iyice birleşene kadar (genellikle iki kez) pipetleyerek karıştırın, ancak çok agresif olmaktan kaçının.
10. Bir pipet ucu kullanarak MEA plakasının her bir oyuğundan laminini çıkarın. Kuyucuk başına 5 x 10⁴ MN ve 2.5 x 10⁴ astrositlik bir hücre yoğunluğu sağlamak için elektrot dizisini kaplayan küçük bir damlacık oluşturarak, son birleşik hücre süspansiyonunun 10 μL'sini her bir oyuğa aktarın.
    not: Kombine süspansiyondaki yüksek hücre yoğunluğu, doğru ve tutarlı hücre sayımları sağlamak için tohumlama adımı sırasında kuyucuklar arasında sık sık yeniden süspansiyon gerektirir.
11. Plakaları 20-30 dakika inkübatöre geri koyun. Hücre damlacığını rahatsız etmemeye ve hücrelerin plakalar üzerinde ilk ekleri oluşturmasına izin vermemeye dikkat edin.
12. 20-30 dakika sonra, her bir oyuğun duvarına 250 μL pipetleyerek ve ardından karşı taraftaki aynı kuyucuğun duvarından 250 μL daha pipetleyerek her bir oyuğa ılık ko-kültür ortamı + ROCK-I ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun.
13. Tohumlamadan sonraki gün plakaları inceleyin (Ko-kültür Günü 1). Önemli hücre kalıntıları veya ölü hücreler varsa, ortamı ROCK-I içeren taze bir ko-kültür ortamı ile değiştirin. Aksi takdirde, tohumlamadan sonraki ikinci gün (Ortak Kültür Günü 2) ortamı ROCK-I içermeyen ortak kültür ortamıyla değiştirin. Haftada iki kez yarı-orta ölçekli değişimler yapın (% 50'sini aspire edin ve buharlaşmayı hesaba katmak için son hacmin% 60'ını ekleyin).
14. Tek kuyulu 30 mm cam plakalı (Malzeme Tablosu) MEA sistemleri kullanılıyorsa, plaka hazırlığı 2 veya daha fazla gün sürebilir. Bunu gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin.
15. Önceki MEA kültürlerinden hücreleri ve hücre kalıntılarını 5-15 dakika boyunca% 0.05 Tripsin ile kaldırın.
16. Tripsin aspire edin ve üç kez su ile durulayın.
17. % 70 etanol ekleyerek sterilize edin ve davlumbazda 10 dakika inkübe edin. Etanolü aspire edin ve ardından üç kez suyla durulayın.
18. Suya proteaz enzimi ile %1'lik anyonik deterjan uygulayın. Plakaları bir kapakla örtün ve termoplastik film ve alüminyum folyo ile sarın ve ardından gece boyunca oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde bırakın.
19. Deterjanı aspire edin ve ardından üç kez suyla durulayın.
20. Plakaları saklamayı planlıyorsanız, yeterli miktarda su ekleyin. Plakaları bir kapakla örtün ve termoplastik film ve alüminyum folyo ile sarın ve bir sonraki kullanıma kadar buzdolabında bırakın.
21. Kaplamayı planlıyorsanız, yüzeyin hücre kültürü kaputunun altında kurumasını bekleyin.
22. Ekstra sterilizasyon gerekiyorsa (ör., önceki enfeksiyon veya yakın zamanda kullanılmamış), yalnızca bu noktada, MEA plakalarını kaputun altında 30-60 dk.
    boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakın not: Sık UV ışığından kaçınmak elektrotların zarar görmesini önleyecektir. Plakaların üzerinde serum varken UV ışığının kullanılması, işlevsel olmayan elektrotlara neden olur, bu nedenle sadece temizlenmiş plakalarda kullanılmalıdır.
23. Plakalar tamamen kuruduğunda, MEA plakalarının cam yüzeyini doldurmak ve kaplama etkinliğini artırmak için 1 dakika boyunca plazma temizliğine devam edin. MEA plaka temizleme-kaplama döngüsünün en az her 4-5 döngüsünde bir plazma temizliği yapın.
    1. Alternatif olarak, plazma temizliği mümkün olmadığında veya garanti edilmediğinde, MEA plakalarının yüzeyini kaplamak için yeterli hacimde fetal sığır serumu (FBS) içeren ortam ekleyin ve bunları gece boyunca inkübatöre geri koyun.
24. PLO (poliornitin)/Laminin kaplama kullanın. Plazma temizliğinden veya FBS içeren ortamı aspire ettikten ve duruladıktan hemen sonra PLO solüsyonu (PBS'de 100 μg) ekleyin.
25. Hücreleri yukarıdaki gibi aşağıdaki yoğunluklarda plakalayın: 1 x 10⁵ insan pluripotent kök hücre türevi astrositler (hiPSC-A) / plaka ve 5 x 10⁵ insan pluripotent kök hücre türevli motor nöronlar (hiPSC-MN) / plaka.

2. Çoklu elektrot dizisi kaydı

1. 200 Hz yüksek geçiren ve 3 kHz düşük geçiren filtreye sahip bir Butterworth filtresi kullanarak 12,5 kHz örnekleme frekansında ham voltaj verilerini çıkarın. Ani yükselme tanımayı, voltajların anlık zaman noktaları ≥ taban çizgisinden 6 standart sapma olarak ayarlayın. Ani artışları 100 ms'de >5 ani artışla bir etkinlik olarak tanımlayın. Toplam aktif elektrotların %35'inden fazlası 100 ms içinde ateşlendiğinde ve ağ patlaması başına en az 50 ani artış olduğunda ağ etkinliğini tanımlayın.
2. Co-Culture (CC) Günü 1.
   'dan sonra mümkün olan en kısa sürede kayda başlayın not: Elektriksel aktivite, CC Gün 3'ten önce nadiren not edilecektir.
3. Benzer yoğunluklarda plaka paralel kültürleri ve biyokimyasal testler, immünositokimya (ICC) veya kantitatif PCR (qPCR) için uygun kültür plakalarında veya lamellerde replikasyonlar.
4. Sıcaklık 37 °C'ye ve CO₂ %5'e ayarlanmışken kayıt yapın. Plakaları makineye aktarın ve kayıttan önce en az 5 dakika dengelenmelerini bekleyin.
5. Deney tasarımına bağlı olarak 1-15 dakika boyunca her gün veya haftalık olarak temel aktiviteyi kaydedin. Orta ölçekli bir değişimden sonra en az 1 saat kayıt yapmayın ve ideal olarak her medya değişiminden sonra 24 saat bekleyin.
6. Kontaminasyonu önlemek için, steril plakanın kapağının steril başlığın dışında açılması gereken herhangi bir kayıttan sonra (yani ilaç bileşiklerinin uygulanması) ortamı değiştirin (yani, adım 1.14'teki gibi yarım orta değişimi). Plakalar ilaç tedavisinden sonra kullanılmaya devam edecekse, ilaçları yıkamak için tam ortam değişimleri ve yıkamaları gerçekleştirin.
7. Analiz amacıyla, her koşul için en az üç teknik ve biyolojik kopya kullanın. Elektrofizyolojik verileri n ≥ 3 replikasyon olarak ifade edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 cm steril kültür plakaları	doğan	353003
25 cm2 steril kültür şişesi	doğan	353136
500 mL 0.2 μm CA Filtre Sistemi	Corning	430769
5 mL pipet	doğan	357543
6 kuyu steril kültür plakası	doğan	3046
Axion CytoView MEA 24 plaka (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platformu	Axion	Maestro Kenar
Temel Membran matrisi - Matrigel	Corning	354277	Protokoldeki detaylar
Tezgah üstü mikroskop (hücre kültürü başlığı altında steril)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Dikey
Siliyer nörotrofik faktör (CNTF)	Peprotech teknolojisi	450-13	100 μg'yi 1 mL steril PBS'de çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Axion Edge için CO2 tankları ve regülatörü	AirGas/Harris	9296NC
DMEM/F12	Termo Balıkçı	113300	Çalışma konsantrasyonu 1x
Esansiyel 8 Orta + Esansiyel 8 Takviyesi	Termo Balıkçı	A1517001	10 mL Esansiyel 8 (10x) takviyesini 500 mL Esansiyel 8 Büyüme Ortamı (1x) ile birleştirin
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Termo Balıkçı	16140071	Çalışma konsantrasyonu 1x
Hemositometre	Seçim Mikroskobu Bilimleri	63510-20
Nem kontrollü Hücre kültürü inkübatörü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	370	37 ºC'ye, %5 CO2'ye ayarlandığında
Laminin	Termo Balıkçı	23017-015	Stok çözeltisi 1 mg/mL, çalışma konsantrasyonu 10 μg/mL (kaplama), 1 μg/mL (hücre ortamı)
L-Glutamin	Termo Balıkçı	25030	10 mM stok elde etmek için 2 mg LDN'yi 500 μL Kloroform içinde çözün. Bunu alın ve -80 ºC'de dondurun. Kullanmak için, önce stoğu 1 ila 10 oranında DMSO'ya [1 mM'ye] seyreltin, ardından 0.2 μM çalışma çözeltisi elde etmek için istenen ortama 1:5000 mM seyreltin
MEA cam plakalar	Çok Kanallı Sistemler	60MEA200/30iR-Ti-gr	Çalışma konsantrasyonu 100x
Çok Kanallı Pipet P200	Gilson	PJ22224
Nörobazal	Termo Balıkçı	21103049
Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)	Termo Balıkçı	11140050	Çalışma konsantrasyonu 1x
Pencillin/Streptomisin	Termo Balıkçı	15140122	Çalışma konsantrasyonu 100x
Poliornitin (FKÖ)	Sigma-Aldrich	P3655 Serisi	Çalışma konsantrasyonu 100x
Potasyum klorür (KCl)	Na	Na	100 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 1 mL ddW'de çözün. Stoku 100 μL'lik tüplerde alikot edin. (çalışma konsantrasyonu 100 μg/mL)
Purmorfamin (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Çalışma konsantrasyonu 100 mM
KAYA İnhibitörü	Peprotech teknolojisi	1293823	Sulandırmadan önce kısa bir süre santrifüjleyin. 100 μg'yi 1 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Steril hücre kültürü davlumbazları	Fırıncı Şirketi	SG-600	10 mM stok elde etmek için 5 mg'ı 1480 μL dH2O'da çözün, alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 500 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 20 μM).
Ek B - B27 Takviyesi	Termo Balıkçı	21985023
Masa üstü hücre kültürü santrifüjü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	75004261	Çalışma konsantrasyonu 50x
Termoplastik film - Parafilm	PARAFILM FILMI	P7793 Serisi	Sorvall Efsanesi X1R
Tripsin-EDTA (% 0.05)	Termo Balıkçı	2530054	Çalışma konsantrasyonu 1x
Su banyosu	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	2332	Isotemp (Isotemp