1. Çok elektrotlu dizi plakalarında MN ve omurilik astrositlerinin birlikte kültürlenmesi
- Motor nöronları ve astrositleri, aynı gün kullanıma hazır olduklarında ve motor nöronlar için in vitro (DIV) 60 ve astrositler için DIV 90 olarak ayırt edin ve plakalayın.
- 24 oyuklu plastik plakalarla çalışıyorsanız, MEA plakalarını kaplamadan bir gün önce veya kaplama gününde aşağıdaki gibi kaplayın (Malzeme Tablosu).
- Poliornitini (PLO) su veya fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 100 μg / mL'ye seyreltin.
- Her bir oyuğa 15-20 μL ekleyin (pipet konfor seviyesine bağlı olarak), kuyunun merkezinde elektrotların alanını ve çevresini kaplayan ancak kuyunun tamamını kaplamayan bir damlacık oluşturun.
- Pipet ucuyla elektrotlara zarar vermemeye dikkat edin. Her kuyuda aynı yüzey alanının kapsanmasını sağlamak için kuyudan kuyuya hacimle tutarlı olun.
- FKÖ'yü 37 °C'de en az 1 saat (tercihen 2 saat) inkübe edin.
not: Plakalarda yeterli nem yoksa küçük hacimler kurur. Kaplama ve kayıtlar boyunca yeterli nemi sağlamak için kuyuları çevreleyen bölmelere su ekleyin.
- Plastik bir mikropipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla FKÖ aspire edin. Elektrotlara dokunmamaya dikkat edin. 250 μL su ile üç kez yıkayın. Yıkamalar için vakumlu aspiratör kullanıyorsanız, ucun elektrot dizisine yaklaşmasına izin vermeyin. Üçüncü yıkamadan sonra, gerektiği kadar bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla suyu alın. Yüzeyi, kapağı çıkarılmış olarak hücre kültürü başlığının altında kurumaya bırakın.
- Plaka yüzeyleri kuruduktan sonra, PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltilmiş laminin ekleyin. Her elektrot dizisini kaplamak için 15-20 μL kullanın. Nem bölmelerine su ekleyin, kapağı yerine takın ve plakayı en az 2 saatten gece boyunca 37 °C inkübasyona geri koyun.
- Kaplama gününde, motor nöron (MN) ve astrosit kültürlerini PBS ile bir kez durulayın ve hücreleri kaldırmak için 37 ° C'de% 0.05 tripsin ekleyin (5 dakika). Tripsin inhibitörü içeren 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için plakaları orta veya baz ile yıkayın. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve 1 mL tek hücreli süspansiyon oluşturmak için 1000 μL'lik bir pipetle yeniden süspanse edin. MN ve astrositleri yeniden süspanse ederken, 20 μM Rho ile ilişkili sarmal bobin oluşturan protein serin / treonin kinaz inhibitörü (ROCK-I) ilavesiyle ko-kültür ortamına (Tablo 1) geçin.
- Bir hemositometre kullanarak MN ve astrositleri paralel olarak sayın. Sayarken ve hesaplamalar yaparken, hücre süspansiyonlarını kapatın ve 4 °C'de bir Strafor rafa yerleştirin.
- Kültürleri motor nöronlar için 5 μL'de 5 x 104 hücre ve astrositler için 5 μL'de 2.5 x 104 hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse etmek için gereken hacmi hesaplayın. 1 mL hücre süspansiyonlarını 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve hesaplanan hacimde yeniden süspanse edin.
- Tohumlanacak istenen kuyucukların sayısını hesaplayın ve bunu her hücre süspansiyonunun 5 μL'si ile çarpın. Gerekli miktarda nöron ve astrosit süspansiyonunu 1:1 oranında birleştirin ve iyice birleşene kadar (genellikle iki kez) pipetleyerek karıştırın, ancak çok agresif olmaktan kaçının.
- Bir pipet ucu kullanarak MEA plakasının her bir oyuğundan laminini çıkarın. Kuyucuk başına 5 x 104 MN ve 2.5 x 104 astrositlik bir hücre yoğunluğu sağlamak için elektrot dizisini kaplayan küçük bir damlacık oluşturarak, son birleşik hücre süspansiyonunun 10 μL'sini her bir oyuğa aktarın.
not: Kombine süspansiyondaki yüksek hücre yoğunluğu, doğru ve tutarlı hücre sayımları sağlamak için tohumlama adımı sırasında kuyucuklar arasında sık sık yeniden süspansiyon gerektirir.
- Plakaları 20-30 dakika inkübatöre geri koyun. Hücre damlacığını rahatsız etmemeye ve hücrelerin plakalar üzerinde ilk ekleri oluşturmasına izin vermemeye dikkat edin.
- 20-30 dakika sonra, her bir oyuğun duvarına 250 μL pipetleyerek ve ardından karşı taraftaki aynı kuyucuğun duvarından 250 μL daha pipetleyerek her bir oyuğa ılık ko-kültür ortamı + ROCK-I ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun.
- Tohumlamadan sonraki gün plakaları inceleyin (Ko-kültür Günü 1). Önemli hücre kalıntıları veya ölü hücreler varsa, ortamı ROCK-I içeren taze bir ko-kültür ortamı ile değiştirin. Aksi takdirde, tohumlamadan sonraki ikinci gün (Ortak Kültür Günü 2) ortamı ROCK-I içermeyen ortak kültür ortamıyla değiştirin. Haftada iki kez yarı-orta ölçekli değişimler yapın (% 50'sini aspire edin ve buharlaşmayı hesaba katmak için son hacmin% 60'ını ekleyin).
- Tek kuyulu 30 mm cam plakalı (Malzeme Tablosu) MEA sistemleri kullanılıyorsa, plaka hazırlığı 2 veya daha fazla gün sürebilir. Bunu gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin.
- Önceki MEA kültürlerinden hücreleri ve hücre kalıntılarını 5-15 dakika boyunca% 0.05 Tripsin ile kaldırın.
- Tripsin aspire edin ve üç kez su ile durulayın.
- % 70 etanol ekleyerek sterilize edin ve davlumbazda 10 dakika inkübe edin. Etanolü aspire edin ve ardından üç kez suyla durulayın.
- Suya proteaz enzimi ile %1'lik anyonik deterjan uygulayın. Plakaları bir kapakla örtün ve termoplastik film ve alüminyum folyo ile sarın ve ardından gece boyunca oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde bırakın.
- Deterjanı aspire edin ve ardından üç kez suyla durulayın.
- Plakaları saklamayı planlıyorsanız, yeterli miktarda su ekleyin. Plakaları bir kapakla örtün ve termoplastik film ve alüminyum folyo ile sarın ve bir sonraki kullanıma kadar buzdolabında bırakın.
- Kaplamayı planlıyorsanız, yüzeyin hücre kültürü kaputunun altında kurumasını bekleyin.
- Ekstra sterilizasyon gerekiyorsa (ör., önceki enfeksiyon veya yakın zamanda kullanılmamış), yalnızca bu noktada, MEA plakalarını kaputun altında 30-60 dk.
boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakın
not: Sık UV ışığından kaçınmak elektrotların zarar görmesini önleyecektir. Plakaların üzerinde serum varken UV ışığının kullanılması, işlevsel olmayan elektrotlara neden olur, bu nedenle sadece temizlenmiş plakalarda kullanılmalıdır.
- Plakalar tamamen kuruduğunda, MEA plakalarının cam yüzeyini doldurmak ve kaplama etkinliğini artırmak için 1 dakika boyunca plazma temizliğine devam edin. MEA plaka temizleme-kaplama döngüsünün en az her 4-5 döngüsünde bir plazma temizliği yapın.
- Alternatif olarak, plazma temizliği mümkün olmadığında veya garanti edilmediğinde, MEA plakalarının yüzeyini kaplamak için yeterli hacimde fetal sığır serumu (FBS) içeren ortam ekleyin ve bunları gece boyunca inkübatöre geri koyun.
- PLO (poliornitin)/Laminin kaplama kullanın. Plazma temizliğinden veya FBS içeren ortamı aspire ettikten ve duruladıktan hemen sonra PLO solüsyonu (PBS'de 100 μg) ekleyin.
- Hücreleri yukarıdaki gibi aşağıdaki yoğunluklarda plakalayın: 1 x 105 insan pluripotent kök hücre türevi astrositler (hiPSC-A) / plaka ve 5 x 105 insan pluripotent kök hücre türevli motor nöronlar (hiPSC-MN) / plaka.
2. Çoklu elektrot dizisi kaydı
- 200 Hz yüksek geçiren ve 3 kHz düşük geçiren filtreye sahip bir Butterworth filtresi kullanarak 12,5 kHz örnekleme frekansında ham voltaj verilerini çıkarın. Ani yükselme tanımayı, voltajların anlık zaman noktaları ≥ taban çizgisinden 6 standart sapma olarak ayarlayın. Ani artışları 100 ms'de >5 ani artışla bir etkinlik olarak tanımlayın. Toplam aktif elektrotların %35'inden fazlası 100 ms içinde ateşlendiğinde ve ağ patlaması başına en az 50 ani artış olduğunda ağ etkinliğini tanımlayın.
- Co-Culture (CC) Günü 1.
'dan sonra mümkün olan en kısa sürede kayda başlayın
not: Elektriksel aktivite, CC Gün 3'ten önce nadiren not edilecektir.
- Benzer yoğunluklarda plaka paralel kültürleri ve biyokimyasal testler, immünositokimya (ICC) veya kantitatif PCR (qPCR) için uygun kültür plakalarında veya lamellerde replikasyonlar.
- Sıcaklık 37 °C'ye ve CO2 %5'e ayarlanmışken kayıt yapın. Plakaları makineye aktarın ve kayıttan önce en az 5 dakika dengelenmelerini bekleyin.
- Deney tasarımına bağlı olarak 1-15 dakika boyunca her gün veya haftalık olarak temel aktiviteyi kaydedin. Orta ölçekli bir değişimden sonra en az 1 saat kayıt yapmayın ve ideal olarak her medya değişiminden sonra 24 saat bekleyin.
- Kontaminasyonu önlemek için, steril plakanın kapağının steril başlığın dışında açılması gereken herhangi bir kayıttan sonra (yani ilaç bileşiklerinin uygulanması) ortamı değiştirin (yani, adım 1.14'teki gibi yarım orta değişimi). Plakalar ilaç tedavisinden sonra kullanılmaya devam edecekse, ilaçları yıkamak için tam ortam değişimleri ve yıkamaları gerçekleştirin.
- Analiz amacıyla, her koşul için en az üç teknik ve biyolojik kopya kullanın. Elektrofizyolojik verileri n ≥ 3 replikasyon olarak ifade edin.
