Yöntem makalesi

Bir Fare Serebral Endotelyumunda Hücre İçi Kalsiyum ve Membran Potansiyelinin Eş Zamanlı Ölçümü

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Hakim, M. A. et al. Yeni İzole Edilmiş ve Sağlam Fare Serebral Endotelinde Hücre İçi Kalsiyum ve Membran Potansiyelinin Eş Zamanlı Ölçümleri. J. Vis. Uzm. (2019)

Video, fare serebral arter segmentlerinin endotel hücrelerinde hücre içi kalsiyum seviyelerinin ve membran potansiyelindeki değişikliklerin eş zamanlı ölçümünü göstermektedir. İzole edilmiş endotel tüpü, bir floresan kalsiyum indikatörü ile yüklenir ve hücre içi kalsiyum salınımını indükleyen bir ilaçla muamele edilir, bu da zar potansiyelinde bir değişikliğe neden olur. İndikatörün floresansı, kalsiyum seviyelerinin ölçülmesini sağlar ve membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçmek için bir hücreye bir kayıt elektrodu yerleştirilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Serebral Arterin Diseksiyonu ve İzolasyonu

>NOT: Tüm diseksiyon prosedürleri, stereomikroskoplar ve fiber optik ışık kaynakları tarafından sağlanan aydınlatma yoluyla numune büyütme (50x'e kadar) gerektirir. Beyin ve arterlerin izolasyonu için diseksiyon prosedürleri gerçekleştirmek için keskin diseksiyon aletleri kullanın. Arterleri izole etmek ve temizlemek için mikrodiseksiyon araçları arasında keskinleştirilmiş ince uçlu forseps ve Vannas tarzı diseksiyon makası (3 ila 9,5 mm bıçaklar) bulunur.

  1. Fare Beyninin İzolasyonu
    1. Bir C57BL / 6 fareyi (3-30 aylık; erkek veya dişi) izofluran inhalasyonu (2-3 dakika boyunca% 3) ile uyuşturun, ardından anestezinin tam indüksiyonunu hemen takiben hayvanın kafasını boşaltın. Kafayı stereomikroskop altında soğuk (4 °C) sıfır Ca2+ Fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) içeren bir Petri kabına (çap 10 cm, derinlik 1,5 cm) yerleştirin.
    2. Mikroskopla görüntülendiğinde, kafatasının üzerindeki deri ve kılları çıkarın ve soğuk sıfır Ca2+ PSS ile fazla kanı alın. Sadece standart diseksiyon makasının (örn. 24 mm bıçak) uçlarını kullanarak, oksipital kemikten başlayıp kafatasının burun kemiğine kadar uzanan bir kesi yapın.
    3. Kaba uçlu forseps kullanarak kafatasını kesi boyunca dikkatlice açın ve beyni sağlam bir Willis Çemberi ile izole etmek için bağ dokusunu ayırın.
      NOT: Alternatif olarak, kafatasını açmak ve beyni açığa çıkarmak için Littauer kemik kesme forseps kullanılabilir.
    4. İzole edilmiş beyni, kanı çıkarmak için bir beherde soğuk sıfır Ca2 + PSS ile nazikçe yıkayın. Serebral arterlerin izolasyonu için soğuk diseksiyon solüsyonu içeren bir odaya beynin ventral tarafını yukarı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 1A).
  2. Serebral Arterlerin İzolasyonu
    NOT:     Posterior serebral arter, bu protokol için temsili bir serebrovasküler endotelyal çalışma modeli olarak seçilmiştir.
    1. İzole edilmiş beyni, bir cam Petri kabının altını (derinlik ≥50 cm) kaplayan kömürle aşılanmış bir silikon polimer içine yerleştirilecek paslanmaz çelik pimler (çap 0,2 mm, uzunluk ~ 11–12 mm) kullanarak soğuk diseksiyon solüsyonunda sabitleyin.
    2. Diseksiyon sırasında soğutulmuş bir PSS sıcaklığını korumak için, sürekli olarak 1: 1 su-etilen glikol karışımını döngüye sokan bir soğutucu akışkan sistemi tarafından soğutulan bir diseksiyon odası kullanın. Alternatif olarak, taze buz üzerinde diseksiyon yapılabilir.
    3. Posterior serebral arterleri (~ 0.3 ila 0.5 cm segmentler, eksenel gerilim yok) posterior komünikasyon ve baziler arterlerden mikrodiseksiyon aletleri, Vannas tarzı makas ve keskinleştirilmiş ince uçlu forseps kullanarak cerrahi olarak izole edin (Şekil 1B). Petri kabındaki diseksiyon solüsyonunda izole edilmiş her iki posterior serebral arteri sabitlemek için paslanmaz çelik pimler (çap 0.1 mm, uzunluk ~ 13–14 mm) kullanın (Şekil 1C).
    4. İzole edilmiş posterior serebral arterleri, keskinleştirilmiş ince uçlu forseps kullanarak bağ dokusunu çıkararak dikkatlice temizleyin (Şekil 1D). Enzimatik sindirim için sağlam arterleri segmentlere (uzunluk 1-2 mm) kesin (Şekil 1D; iç).

2. Endotel Tüpünün Hazırlanması ve Süperfüzyon

  1. Objektiflerle donatılmış bir mikroskop (10x, 20x ve 40x), bir kamera ve bir oda ve mikromanipülatörler tutan bir alüminyum sahne kullanarak öğütme aparatını hazırlayın. Bir mikroşırıngayı, aşamaya ve numuneye bitişik bir pompa kontrolörü ile sabitleyin (Şekil 2A).
  2. Bir öğütme pipetini tamamen mineral yağ ile doldurun ve mikro şırınga pistonunun üzerine sabitleyin. Ardından, pompa kontrolörlü mikro şırıngayı kullanarak, pipette hava kabarcıkları olmadığından emin olurken, ayrışma solüsyonunu mineral yağın üstündeki pipete (~ 130 nl) çekin.
  3. Sağlam arteriyel segmentleri, 0.31 mg / mL papain, 0.5 mg / mL ditioeritritol, 0.75 mg / mL kollajenaz ve 0.13 mg / mL elastaz içeren 10 mL'lik bir cam tüpte (Şekil 2B) 1 mL ayrışma çözeltisine yerleştirin. Kısmi sindirim için 34 °C'de 10-12 dakika inkübe edin.
  4. Sindirimi takiben, enzim çözeltisini ~ 5 mL taze ayrışma çözeltisi ile değiştirin. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, bir segmenti oda sıcaklığında (RT) ayrışma solüsyonunu içeren bir odaya aktarın.
  5. Pipeti haznedeki ayrışma solüsyonuna yerleştirin ve sindirilmiş kabın bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Nazik öğütme için pompa kontrol cihazında 2 ila 5 nL/s aralığında bir hız ayarlayın (Şekil 2C; ek).
  6. 100x ila 200x büyütme ile görüntülerken, bir endotel tüpü üretirken düz kas hücrelerini ayırmak için arteriyel segmenti geri çekin ve çıkarın. Gerekirse, ayrışmış adventiti ve iç elastik laminayı endotel tüpünden ayırmak için dikkatlice ince uçlu forseps kullanın. Tüm düz kas hücrelerinin ayrıştığını ve sadece endotel hücrelerinin sağlam bir "tüp" olarak kaldığını doğrulayın (Şekil 2C).
  7. Mikromanipülatörler kullanarak, endotel tüpünün her iki ucunu borosilikat cam iğneleme pipetleri kullanarak süperfüzyon odasının cam kapak kızağına sabitleyin (Şekil 2D).
  8. Dissosiyasyon adventitia ve düz kas hücrelerini odadan yıkayın ve dissosiyasyon solüsyonunu 2 mM CaCl2 PSS ile değiştirin. Güvenli endotel tüpü ile mobil platformu süperfüzyon mikroskobu ve deney teçhizatı üzerine aktarın.
  9. Deney sırasında PSS ve ilgili ilaç çözeltilerinin uygun şekilde sürekli verilmesi için 6 temiz 50 mL rezervuar (Şekil 3A) kullanın. Akış beslemesini vakumlu emişle eşleştirirken akış hızını laminer akışla tutarlı olarak manuel olarak ayarlamak için hat içi akış kontrol valfini kullanın. Arka plan verilerini ve boya yüklemesini kaydetmeden önce endotel tüpünün süperfüzyonu için PSS'yi ≥ 3 dakika boyunca odaya (Şekil 5B) verin.

3. Boya Yükü, Yıkama ve Sıcaklık Ayarları

  1. [Ca2+]i'yi ölçmek için fotometri sisteminin tüm bileşenlerini açın. Endotel tüpünü 400x büyütmede görüntülemek için deney teçhizatındaki (Şekil 3C) mikroskobu kullanın ve fotometri sistemi yazılım paketini kullanarak fotometrik penceredeki hücrelere odaklanın.
  2. Endotel tüpünün çapını ölçün ve 340 ve 380 nm'de (≥10 Hz) alternatif uyarma sırasında 510 nm emisyona göre arka plan otofloresan değerlerini kaydedin.
  3. Hücre içi Ca2 + ([Ca2 +] i) yanıtlarını ölçmek için, endotel tüpünü RT'de Fura-2 boyası (Fura-2-asetoksimetil ester, 10 μM nihai konsantrasyon) ile yükleyin ve ışık yokluğunda ~ 30-40 dakika bekleyin.
  4. Fazla boyayı yıkamak ve hücre içi Fura-2'nin esterleşmesini sağlamak için endotel tüpünün süperfüzyonunu ~ 30-40 dakika boyunca taze PSS ile yeniden başlatın. Yıkama süresi boyunca, bir hat içi ısıtıcı ile sıcaklık kontrol cihazını (Şekil 3A) kullanarak sıcaklığı kademeli olarak RT'den 37 °C'ye yükseltin, ardından deney boyunca 37 °C'de tutun.
    not: RT ile 37 °C arasında önerilen artımlı geçiş, her adımda ≥5 dakikalık bir dengeleme süresi ile üç adım (örneğin, 5 °C) gerektirir.

4. [Ca2+]i ve Vm'nin Eşzamanlı Ölçümü

  1. Membran potansiyelini ölçmek için diğer tüm ekipmanı ve elektrometre yazılım takımını açın (Vm, bkz. Şekil 3, Şekil 4). Veri toplama hızını buna göre ayarlayın (≥10 Hz).
  2. Keskin bir elektrot çekin ve 2 M KCl ile doldurun. Boya transferi yoluyla hücreler arası eşleşme çalışmaları için, mikroelektrotları 2 M KCl'de çözünmüş %0.1 propidyum iyodür ile doldurun.
  3. Elektrodu, bir mikromanipülatör ile sabitlenmiş bir elektrometre kafası aşamasına bağlı pipet tutucusunda klorür ile kaplanmış gümüş bir tel üzerine sabitleyin. Elektrotun ucunu odadaki akan PSS'ye kısa bir süre konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın.
  4. Dinlenme Vm'yi topraklanmış banyo potansiyeline uygun olarak 0'a ayarlayın. Elektrotun ucunu endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine yerleştirin. İstenirse, ses perdesini olası kayıtlarla ilişkilendirmek için elektrometrelere bağlı sesli temel monitörler kullanın.
  5. 40x objektifi kullanarak büyütmeyi 400x'e yükseltin ve elektrotun ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın. ~ 50 ila 80 endotel hücresine odaklanmak için fotometri yazılımını kullanarak fotometrik pencereyi ayarlayın.
  6. Mikromanipülatörü kullanarak elektrodu nazikçe endotel tüpünün hücrelerinden birine yerleştirin ve kalan Vm'nin stabilize olması için ≥2 dakika bekleyin. Benzer şekilde, ikinci bir elektrotu, ilk elektrotla saplanmış ilk hücreden başka bir hücreye (≥100 μm mesafe) yerleştirin.
  7. Dinlenme Vm beklenen değerlerinde (-30 ila -40 mV) stabil olduğunda, ışık yokluğunda floresan arayüzünde PMT'yi açın ve 510 nm'de floresan emisyonu toplarken 340 ve 380 nm'de dönüşümlü olarak (10 Hz) Fura-2'yi uyararak hücre içi [Ca2+]i edinmeye başlayın.
    NOT: Hücreler arası elektriksel kuplajı test etmek için, akım (± 0.5-3 nA, ~20 s darbe süresi) bir elektrometre aracılığıyla "Site 1" olarak verilebilir ve Vm'deki değişiklikler başka bir elektrometre ile "Site 2" olarak kaydedilebilir (mesafe ≥100 μm).
  8. Vm ve [Ca2 +] i'nin eşzamanlı ölçümleri yapıldıktan sonra, ilaçların uygulanmasından önce endotel tüpünün PSS ile sabit bir laminer akış hızında süperfüzyonu için ~ 5 dakika bekleyin.
  9. PSS'de hazırlanan ilacı (örneğin, adenozin trifosfat [ATP]) sabit akış hızı ile süperfüzyon odasına uygulayın. ~ 3 dakika sonra (veya ilacın kinetiği için uygun bir süre sonra), Vm ve F340 / F380 oranı başlangıç koşullarına dönene kadar PSS ile yıkayın. Çözümlerin her geçişi sırasında ilgili kayıtları fotometre ve elektrometre yazılım paketleri arasında geçici olarak senkronize edilmiş olarak işaretleyin.
  10. Deney yapıldıktan sonra, mikromanipülatörü kullanarak elektrodu hücreden çekin ve banyo elektrodu tarafından referans alındığı gibi Vm ~ 0 mV'ye dikkat edin. Vm ve [Ca2+]i'nin ilgili kayıtlarını durdurun ve kayıtları veri analizi için dosyaya kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: Serebral arterin beyinden izolasyonu. (A) Beyin, desesection solüsyonunda sağlam arterlerle (beyaz ok posterior serebral arteri gösterir) izole edilmiştir. (B) Posterior serebral arterin büyütülmüş görünümü (beyaz ok; ~3x vs. Panel A). (C) İzole edilmiş posterior serebral arterler, numune kabında paslanmaz çelik pimlerle sabitlenmişt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
glikozSigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri)G7021
NaCl (Doğal)SigmaS7653 Serisi
MgCl2SigmaM2670
CaCl2Sigma223506
HEPES ÜNİVERSİTESİSigmaH4034
KartalSigmaP9541 Serisi
NaOH (NanoOHSigmaS8045 Serisi
AtpSigmaA2383
HclThermoFisher Scientific (Pittsburgh, Pensilvanya, ABD)A466250
Kollajenaz (H Tipi Karışım)SigmaC8051
DitiyoeritritolSigmaD8255
Papaz OtuSigmaP4762 Serisi
ElastazSigmaE7885
BsaSigmaA7906
Propidyum iyodürSigmaP4170 Serisi
DMSO (Türkçe)SigmaD8418
Fura-2 boyaInvitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Birleşik DevletleriF14185
Devridaim soğutucusu (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Bilimsel13874647
Pleksiglas süperfüzyon odası Warner Instruments, Camden, CT, ABDRC-27
Cam lamel alt (2,4 × 5,0 cm)ThermoFisher Bilimsel12-548-5 milyon
Eloksallı alüminyum platform (çap: 7,8 cm) Warner EnstrümanlarıPM6 veya PH6
Kompakt alüminyum tabla Siskiyou, Hibe Kartı, VEYA, ABD8090P
MikromanipülatörSiskiyou MX10
Stereomikroskoplar Zeiss, NY, Amerika Birleşik DevletleriStemi 2000 ve 2000-C
Fiber optik ışık kaynakları Schott, Mainz, Almanya & KL200, ZeissFostec 8375 Serisi
Nikon ters mikroskopNikon Instruments Inc, Melville, NY, Amerika Birleşik DevletleriTs2
Faz kontrastı hedefleri Nikon Instruments Inc (Ph1 DL; 10X ve 20X)
Floresan objektifler Nikon Instruments Inc20X (S-Flor) ve 40X (Plan Flor)
Nikon ters mikroskopNikon Instruments IncTutulma TS100
Mikroşırınga pompa kontrolörü (Micro4 ) Dünya Hassas Aletleri (WPI), Sarasota, FL, ABDSYS-MICRO4
Titreşim izolasyon tablosuTeknik Üretim, Peabody, MA, ABD Mikro-g
AmplifikatörlerMoleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABDAxoclamp 2B ve Axoclamp 900A
Sahne Başlıkları Moleküler CihazlarHS-2A ve HS-9A
Fonksiyon üreteci EZ Digital, Seul, Güney KoreFG-8002
Veri Edinme SistemiMoleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABDDijital veri 1550A
Sesli Temel MonitörlerAmpol US LLC, Sarasota, FL, Amerika Birleşik Devletleri BM-A-TM
Dijital Depolama OsiloskopuTektronix, Beaverton, Oregon, Amerika Birleşik Devletleri Teknik Direktör 2024B
Floresan Sistem Arayüzü, ARC Lambası + Güç Kaynağı, Hyperswitch, PMTMoleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABDIonOptix Sistemleri
Sıcaklık kontrolörü Warner EnstrümanlarıTC-344B veya C
Hat İçi Isıtıcı Warner EnstrümanlarıŞ- 27B
Valf Kontrol Cihazı Warner EnstrümanlarıVC-6
Hat İçi Akış Kontrol VanasıWarner Enstrümanları FR-50
Elektronik Çektirme Sutter Aletleri, Novato, CA, ABDP-97 veya P-1000
Mikro ForgeNarishige, Doğu Çayırı, NY, ABD MF-900
Borosilikat Cam Tüpler (Triturasyon)Dünya Hassas Aletleri (WPI), Sarasota, FL, ABD1B100-4
Borosilikat Cam Tüpler (Sabitleme)Warner EnstrümanlarıG150T-6
Borosilikat Cam Tüpler (Keskin Elektrotlar)Warner EnstrümanlarıGC100F-10
Şırınga Filtresi (0.22 μm) ThermoFisher Bilimsel722-2520
Cam Petri Kabı + Kömür SylgardYaşam Sistemleri Enstrümantasyonu, St. Albans City, VT, ABDDD-90-S-BLK
Vannas Stil Makas (3 mm ve 9,5 mm)Dünya Hassas Aletler555640S, 14364
Makas 3 ve 7 mm bıçaklarGüzel Bilim Araçları (veya FST), Foster City, CA, ABDMoria MC52 ve 15000-00
Bilenmiş ince uçlu forseps FST (Türkçe)Dumont #5 ve Dumont #55
Serisi Serisi Serisi ) Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Belediyesi Serisi Serisi Serisi Serisi Teknolojisi Serisi Serisi Serisi Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre i Kalsiyum l mMembran Potansiyeli KaydFloresan Kalsiyum ndikat rEndotelyal T p zolasyonuE Zamanl Kay tFura 2 Boyas Y klemeElektrot Yerle tirmela Kaynakl Kalsiyum Sal n mKalsiyuma Ba ml Potasyum Kanallar

İlgili makaleler