Yöntem makalesi

Bir Ko-Kültürde Nöral Bağlantı Oluşumunun Elektrofizyolojik Kayıtlar Kullanılarak Değerlendirilmesi

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Su, C. T. E., et al. Bir Ko-kültür Sisteminde Nöronal Bağlantıların Oluşumunu Değerlendirmek İçin Optogenetik Bir Yaklaşım. J. Vis. Uzm. (2015)

Video, iPSC'den türetilen ve sıçan kortikal nöronları arasındaki nöral bağlantıları değerlendirmek için elektrofizyolojik kaydı gösterir, ışığa duyarlı iyon kanallarını aktive ederek ve postsinaptik akımları tespit ederek ko-kültürdeki sinaptik temasları doğrular.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. iPSC'den Türetilmiş Nöronların Elektrofizyolojik Kayıtları

  1. İnsan iPSC'lerinin olgun nöronlar gibi davranıp davranmadığını doğrulayın.
    1. 60X (0.9 NA) suya daldırma lensi ile donatılmış dik bir konfokal mikroskop kullanarak tdTomato'nun görselleştirilmesi ile insan iPSC'lerinden farklılaşan hücreleri bulun.
    2. Kayıt pipetini 4 ila 6 M'lik bir dirence çekin. Hücreleri, oda sıcaklığında% 95 O2 /% 5 CO2 ile sürekli olarak köpürtülmüş harici bir çözelti içinde perfüze edin. Kayıt mikropipetini dahili solüsyonla doldurun.
    3. tdTomato+ hücresini tam hücre modunda yamalayın ve akım kelepçesindeki akım enjeksiyonuna (1 saniye süre, 10 pA artışlar) yanıt olarak aksiyon potansiyeli ateşlemesini kaydedin.
  2. ChR2 eksprese eden kortikal hücrelerin aksiyon potansiyelinin ışık stimülasyonu ile güvenilir bir şekilde uyarılıp uyarılmadığını onaylayın.
    1. Konfokal mikroskop altında GFP'yi görselleştirerek ChR2 eksprese eden kortikal hücreleri bulun. 1.1.2 ila 1.1.3 arasındaki adımları izleyerek kortikal hücreler üzerinde tam hücre yama kelepçesi kaydı gerçekleştirin.
    2. Cıva ark lambası (100 W) ile ışık aydınlatması ile aksiyon potansiyelinin güvenilir bir şekilde uyandırıldığını kontrol edin. Uyarma filtresinin dalga boyu 480/40 nm'dir.
  3. Optogenetik stimülasyon gerçekleştirin.
    1. tdTomato+ hücresini tam hücre modunda yamalayın ve voltaj kelepçesini -70mV'ye ayarlayın. Akım sinyallerini 2 kHz'de filtreleyin ve 10 kHz'de sayısallaştırın. Kayıtlar sırasında tutarlılık için 10 ila 20 M arasında değişen seri dirençleri izleyin.
    2. 480/40 nm uyarma filtreli 100 W cıva lambası ile tüm alanı 30 saniye boyunca uyarın.
    3. ChR2 eksprese eden presinaptik kortikal nöronların fotostimülasyonu ile indüklenen yamalı hücrelerin postsinaptik akımlarını (PSC'ler) kaydedin. PSC'leri tespit edin ve ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NaCl (Doğal)SigmaS7653 Serisi
KartalSigmaP5405 Serisi
NaHCO3SigmaS5761 Serisi
NaH2PO4Fluka Çiçeği71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D (+) - GlikozSigmaG7520Elektrofizyolojik çalışmalar için
K-glukonatSigmaP1847 Serisi
KohKANTO Kimya3234400
HEPES ÜNİVERSİTESİSigmaH3375Elektrofizyolojik çalışmalar için
EGTA (EGTA)SigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
Borosilikat cam kılcal damarlarDünya hassas aletler, Inc1604323
Cıva kısa ark lambasıİSGİM DEVLETLERİHBO 103 W/2
Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektrofizyolojik Kay tOptogenetik Stim lasyonT m H cre Yama KenetlemeKonfokal MikroskopiPostsinaptik Ak mlarI a Duyarl yon KanallariPSC K kenli N ronlarS an Kortikal N ronlarKo K lt r SistemiSinaptik Ba lant De erlendirmesi

İlgili makaleler