$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Örnekleme kurulumu ve hazırlığı
- Earle'ün dengeli tuz çözeltisini (EBSS) sodyum bikarbonat (100 mL EBSS'de 0,44 g) ve glikoz (100 mL EBSS'de 0,884 g) ile tamamlayın9. EBSS'yi DEPC (100 mL EBSS başına 0.1 mL) ile otoklavlanabilir bir şişede veya vidalı bir şişede 37 ° C'de en az 12 saat
tedavi edin.
- 5 3/4" cam Pasteur pipetini 1000 mL'lik bir cam behere yerleştirin ve sanatçının fırçalarını kılları yukarı bakacak şekilde 100 mL'lik cam dereceli bir silindire yerleştirin. Pipetleri ve fırçaları kaplamak için yeterli DEPC solüsyonu (100 mL ddH2O başına 0,1 mL) ekleyin. Beher ve dereceli silindiri alüminyum folyo ile örtün ve 37 ° C'de en az 12 saat inkübe edin.
- DEPC ile 12 saatlik inkübasyondan sonra, DEPC ile muamele edilmiş tüm malzemeleri en az 15 dakika boyunca >100 °C sıcaklığa ısıtın. EBSS'yi çıkarın ve 4 °C'de saklamadan önce oda sıcaklığına soğutun. ddH2O'yu beherden ve dereceli silindirden uzağa dökün; malzemeler kuruyana kadar >100 °C'de inkübe etmeye devam edin. Çıkarın, oda sıcaklığına soğutun ve daha sonra kullanmak üzere saklayın.
- Deney gününde, tüm çalışma yüzeylerini RNaseZap ile işlemden geçirin.
- EBSS'yi 40 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve bakımını yapın. EBSS'yi tamponlamak ve oksijenlendirmek için, gaz tüpünü RNaz içermeyen bir Pasteur pipetine yerleştirerek ve pipeti EBSS'ye yerleştirerek %95/%5 O2 / CO2 ile sızın. EBSS konteynerinin ağzını kapatın.
- Beyin dokusunun seri kesitlerinde kullanılmak üzere bir Stoelting doku dilimleyici kurun. Doku dilimleyicinin üst ve alt yüzeylerini RNaseZap ile tedavi edin. Dikdörtgen bir parça Whatman #4 filtre kağıdını doku doğrayıcının pleksi cam yüzeyine yapıştırın. Doğrayıcı koluna çift kenarlı bir tıraş bıçağı takın. Mikrometreyi sıfıra ayarlayın ve doğrayıcı kolunun minimum yüksekliğini, tıraş bıçağının filtre kağıdını kesmesine izin verecek, ancak pleksi cam plakayı kesmeyecek şekilde ayarlayın.
- RNaz içermeyen 60x15 mm hücre kültürü kapları, Harris Uni-Core doku karotları, mikronumune delme sırasında koronal beyin bölümlerinin EBSS oksijenasyonu için gaz tüplerine yapıştırmak için 200 μL RNaz içermeyen mikropipet uçları, kavisli makaslar, kuru buz ve doku toplama için tüpler dahil olmak üzere mikrodiseksiyon için gerekli tüm ek malzemeleri toplayın. Tüpleri kuru buzun üzerine yerleştirin.
2. Beyin çıkarma ve koronal kesit alma
- Fareyi bir DecapiCone'ye yerleştirin ve bir kemirgen giyotini kullanarak kafasını kesin. Kafayı DecapiCone'dan çıkarın ve düz bir yüzeye yerleştirin. Bir neşter kullanarak, cildi burun deliğine yaklaşık 3 mm kaudalden başlayarak kafatasının orta hattından aşağı doğru kesin. Kafatası ve göz yuvalarını ortaya çıkarmak için cilt kanatlarını yanal olarak soyun.
- Kavisli makas kullanarak, her iki optik siniri de kesin ve gözle olan bağlantılarını kesin. Oksipital ve interparietal kemikleri dikkatlice kırarak ve dorsal parietal ve frontal kemikleri çıkararak kafatası boşluğunu açın. Bir kemik rongeur kullanarak, koku soğancıklarını ortaya çıkarmak için burun ve lakrimal kemikleri kırın. Koku ampullerini rostral beyinden kesmek için kavisli makas kullanın. Arka beyin sağlam olarak tüm beyni çıkarın. Beyni 60 x 15 mm'lik RNaz içermeyen bir Cellstar hücre kültürü kabının üstüne yerleştirin. Doku örnekleme çalışma yüzeyine aktarın.
- Filtre kağıdını EBSS ile bağlı doku doğrayıcıya konservatif bir şekilde nemlendirmek için RNaz içermeyen bir pipet kullanın. Beyin dokusunu EBSS ile ıslatın.
- Beyni doku kıyıcıya aktarın ve uygun yönlendirmeyi ayarlayın. Not: Beyin, ventral yüzey filtre kağıdına dayanacak şekilde konumlandırılmalıdır. Orta hat (interhemisferik fissür) doğrayıcı bıçağına dik olmalı ve beynin rostral kenarı bıçağa dayanmalıdır.
- Beynin sırt yüzeyine hafif bir baskı uygulayarak beyni sabit tutmak için DEPC ile tedavi edilmiş bir sanatçının fırçasını kullanın. Beyni sabit tutarken, bıçak tutucu kolunu sırt dokusu yüzeyinin yaklaşık 4-5 cm yukarısına kaldırın ve bu pozisyonda tutun. Fırçayı beyin yüzeyinden çıkarın ve mikrometreyi kullanarak 750 μm'yi çevirin. Kolun düşmesine izin verin, dokuyu doğrayın ve 750 μm'lik bir koronal bölüm oluşturun.
- Doğrayıcı bıçak sabit kalırken, doku bölümünü bıçak yüzeyinden nazikçe kaydırmak için sanatçının fırçasıyla yuvarlanma hareketi yapın. Doku bölümünü hemen petri kabındaki oksijenli EBSS'ye yerleştirin. İkinci bir araştırmacı adım 3.1'den başlayabilir.
- Tüm rostro-kaudal düzlem boyunca seri beyin kesitleri elde edilene kadar 2.5 ve 2.6 adımlarını tekrarlayın.
3. Beyin bölgesi mikrodiseksiyonu
- Doku mikrodiseksiyonu sırasında numune aydınlatmasının engellenmemesini sağlamak için aydınlatmayı ayarlayın. Mikrodiseksiyon sırasında doku için tamponlu, oksijenli bir ortam sağlamak için% 95 /% 5 O2 / CO2 karışımının konumunu ve akışını ayarlayın.
- İlgilenilen bölgeyi içeren koronal beyin bölümünü tanımlayın. Beyin bölümünü, bir sanatçının fırçasını kullanarak petri kabının dibine düz bir şekilde yönlendirin. Tablo 1'e veya diğer referanslara göre uygun çapa sahip doku çekirdeğini seçin. Koronal doku bölümünü sanatçının fırçası ile yerinde tutarken, doku çekirdeğinin kesici ucunu doku bölümünün yüzeyi üzerine getirin.
- Basınç uygularken, doku çekirdeği ucunu doku bölümünden ve petri kabının dibine sıkıca bastırın. İlgilenilen bölgenin çevredeki dokudan ayrıldığından emin olmak için yuvarlanan dairesel bir hareket kullanın. Doku çekirdeğini doku bölümünden dikkatlice kaldırın ve mikropunchı serbest bırakarak EBSS'de yüzmesine izin verin.
- Bir sanatçının fırçasını kullanarak, doku mikropunchını hemen kuru buz üzerinde tutulan -80 °C'ye dayanıklı bir saklama tüpüne bırakın. Doku, tüpün yan tarafına kolayca yapışmalıdır. Mikronumune içeren tüpü kuru buza geri koyun.
- İlgilendiğiniz her beyin bölgesi için 3.2 - 3.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
4. Doku arşivi
- Mikrodiseksiyon tamamlandıktan sonra, numune içeren her bir TrakMates tüpü için ilgili barkodları kaydetmek üzere VisionMate tarayıcı sistemini kullanın. 96 yuvalı TrakMates tüp rafı dolduktan sonra, rafı hızlı bir şekilde tarayın ve doku örneklerini RNA ekstraksiyonuna kadar hemen -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
5. Toplam RNA ekstraksiyonu
- RNaseZap kullanarak RNase içermeyen bir çalışma alanı hazırlayın. MagMAX-96 Toplam RNA İzolasyon Protokolü10'da açıklandığı gibi yeterli miktarda manyetik Boncuk Karışımı ve Lizis/Bağlama Çözeltisi hazırlayın.
- Doku örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve tüpleri doğrudan kuru buzun üzerine yerleştirin.
- Numune içeren bir TrakMates tüpüne 100 μL Lizis / Bağlama Çözeltisi ekleyin. Pelet karıştırıcıya nükleaz içermeyen 0.5 ml tüp büyüklüğünde bir havaneli takın ve dokuyu homojenize edin. Düşük retansiyonlu nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak, homojenize numuneyi yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakası üzerindeki bir kuyuya aktarın. Düşük tutma noktalı nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak numuneye hemen 60 μL %100 izopropanol ekleyin ve 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Düşük tutma noktalı nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak numuneye 20 μL Boncuk Karışımı ekleyin. 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Tüm doku örnekleri için 5.3-5.4 adımlarını tekrarlayın.
- Toplam RNA ekstraksiyonunu tamamlamak için III.A.96'den başlayan MagMAX-2 Toplam RNA İzolasyon Protokolü adımlarını izleyin. not: Diğer manyetik boncuk özellikli toplam RNA izolasyon kitleri ticari olarak temin edilebilir; ancak bu çalışmada incelenmemiştir. İlgili ürünleri kullanarak toplam RNA izolasyonunun ayrıntıları için lütfen üreticinin kit kılavuzlarına bakın.
- Bir NanoDrop 3300 spektrofotometre veya diğer küçük hacimli spektrofotometre/florometre teknolojilerini kullanarak elde edilen toplam RNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu ölçün.
6. Temsili Sonuçlar:
Beyin Bölgesi/Çekirdek
Doku Korer Çapı (mm)
Toplam RNA (ng/μL)
260/280 Oranı
Frontal Korteks
2,0
27.03
1,99
Çekirdek Accumbens
1,0
6,26
2,77
Striatum
1.5
27,94
2,19
Singulat Korteks
1.5
29,05
2,07
Hipotalamus - Paraventriküler Çekirdek / Suprakiazmatik Çekirdek (PVN/SCN)
2,0
40,34
2,03
talamus
2,0
34,40
2.00
Hipotalamus - Dorsomedial Çekirdek / Ventromedial Çekirdek (DMH/VMH)
2,0
44,83
2,05
Amigdala
1,0
Saat 10.06
1,89
Hipokampus - Ca 2/3
1.5
7,31
2,32
Hipokampus - Ca1/Dentate Gyrus
1.5
5,20
2,24
Periaqueductal Gri
1,0
48,21
2,02
Dorsal Raphe Çekirdeği
1,0
6,56
2,18
Retiküler Oluşum
2,0
35,35
2,27
Tablo 1. Mikrodiseke fare beyin bölgelerinin ilgili optimal doku korer çapları, temsili toplam RNA verimi ve saflığı ile numaralandırılması. Rostro-kaudal sıraya göre listelenen 13 mikrodiseke beyin bölgesi, boyut ve yönelim bakımından farklılık gösterir. PVN/SCN mikropunch, anteromedial paraventriküler çekirdeği, periventriküler çekirdeğin bölümlerini, sub-paraventriküler bölgeyi ve diğer parvosellüler nöronları içerir. Talamus mikropunch, PVN/SCN mikropunch bölgesi ile aynı koronal düzlemde yer alan anterior talamik çekirdekleri içerir. DMH/VMH mikropunch, dorsomedial çekirdek ile ventromedial çekirdek arasında yer alan aksesuar magnoselüler çekirdekleri ve diğer parvosellüler nöronları içerir. Amigdala örneği hem merkezi hem de bazolateral alt bölgeleri içerir. RNA verimi ve 260/280 oranları, her bir beyin bölgesinden elde edilen okumaları göstermek için ilgili mikrodiseksiyon örneklerinden elde edilen tek değerlerdir.