Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım
Bu makalede
Özet
Özet
Teknolojik platformlar olarak yeni nesil dizileme, mikro dizi ve qRT-PCR gibi yaklaşımlar, moleküler düzenlemenin kapsamına dair anlayışımızı genişletmek açısından büyük vaatler sunmaktadır. Yüksek çözünürlüklü RNA dizileme (RNA-Seq)1 gibi daha yeni yaklaşımlar; bağıl transkript seviyeleri, alternatif ekleme ve mikro RNA'lar2-4 gibi dokuya veya duruma özgü ekspresyona dair yeni ve geniş kapsamlı bilgiler sağlamaktadır. Belirli dokular içinde veya fenotipik olarak farklı birey grupları arasında karşılaştırmalı tüm transkriptom profilleme5 yönteminde RNA-Seq yönteminin kullanılma imkanları, hem normal hem de anormal fizyolojik durumlarda yer alan moleküler mekanizmaların aydınlatılması için yeni yollar açmaktadır. Yakın zamanda, insan beyin dokusu üzerinde tüm transkriptom profilleme gerçekleştirilerek hastalık ilerlemesiyle ilişkili gen ekspresyon farklılıkları tanımlanmıştır6. Ancak, yeni nesil dizilemenin kullanımı memeli çalışmalarıyla henüz daha yaygın bir şekilde entegre edilmemiştir.
Fare modellerindeki gen ekspresyon çalışmaları, örnek eksizyonu için lazer yakalama mikroskobisi (LCM) kullanarak çeşitli beyin çekirdekleri içinde belirgin profiller rapor etmiştir7,8. LCM, tek hücre ve ayrı beyin bölgesi hassasiyetinde örnek toplamaya olanak tanısa da, LCM yaklaşımından elde edilen nispeten düşük toplam RNA verimleri, fare beyin dokularındaki RNA-Seq ve diğer profilleme yaklaşımları için engelleyici olabilir ve suboptimal örnek amplifikasyon adımları gerektirebilir. Burada, ayrı fare beyin bölgelerinden mikrodiseksiyon ve toplam RNA ekstraksiyonu için bir protokol sunulmaktadır. Tek bir fare beyninin 750-μm'lik seri koronal kesitlerinden 13 dokuyu izole etmek için sabit çaplı doku korerleri kullanılır. Doku mikropunch örnekleri derhal dondurulur ve arşivlenir. Toplam RNA, manyetik boncuk destekli toplam RNA izolasyon teknolojisi kullanılarak örneklerden elde edilir. Ortaya çıkan RNA örnekleri, alt akış ekspresyon profillemesinde kullanım için yeterli verim ve kaliteye sahiptir. Bu mikrodiseksiyon stratejisi, ayrı beyin bölgelerinden toplam RNA elde etmek için mevcut örnek toplama stratejilerine uygulanabilir bir seçenek sunarak yeni gen ekspresyon keşifleri için olanakları artırmaktadır.
Protokol
1. Örnekleme düzeneği ve hazırlık
- Earle dengeli tuz çözeltisini (EBSS), sodyum bikarbonat (100 mL EBSS başına 0,44 g) ve glikoz (100 mL EBSS başına 0,884 g) ile tamamlayın9. EBSS'yi, vidalı kapaklı otoklavlanabilir bir şişe veya erlen içinde, 37 °C'de en az 12 saat boyunca DEPC (100 mL EBSS başına 0,1 mL) ile işleyin.
- 5 ¾" cam Pasteur pipetlerini 1000 mL'lik bir cam behere, kılları yukarı bakacak şekilde resim fırçalarını ise 100 mL'lik bir cam mezüre yerleştirin. Pipetleri ve fırçaları sırasıyla örtecek miktarda DEPC çözeltisi (100 mL ddH2O başına 0,1 mL) ekleyin. Beheri ve mezürü alüminyum folyo ile kapatın ve 37 °C'de en az 12 saat inkübe edin.
- DEPC ile 12 saatlik inkübasyonun ardından, DEPC ile işlenmiş tüm malzemeleri en az 15 dakika boyunca >100 °C sıcaklığa ısıtın. EBSS'yi çıkarın ve 4 °C'de saklamadan önce oda sıcaklığına soğutun. Beher ve mezürdeki ddH2O'yu boşaltın; malzemeler kuruyana kadar >100 °C'de inkübe etmeye devam edin. Malzemeleri çıkarın, oda sıcaklığına soğutun ve daha sonra kullanmak üzere saklayın.
- Deney günü, tüm çalışma yüzeylerini RNaseZap ile temizleyin.
- EBSS'yi 40 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve burada tutun. EBSS'yi tamponlamak ve oksijenlendirmek için, bir gaz hortumunu RNase-free bir Pasteur pipetine yerleştirip pipeti EBSS'nin içine sokarak %95/%5 O2/CO2 ile infiltre edin. EBSS kabının ağzını kapatın.
- Beyin dokusunun seri kesitlerinin alınması için bir Stoelting doku dilimleyiciyi hazırlayın. Doku dilimleyicinin üst ve alt yüzeylerini RNaseZap ile temizleyin. Pleksi cam yüzeye dikdörtgen bir parça Whatman #4 filtre kağıdı yapıştırın. Dilimleyici koluna çift kenarlı bir jilet takın. Mikrometreyle sıfırlama yapın ve jiletin filtre kağıdını kesmesine ancak pleksi cam plakayı kesmemesine izin verecek şekilde dilimleyici kolunun minimum yüksekliğini ayarlayın.
- Mikrodiseksiyon için gerekli olan; RNase-free 60x15 mm hücre kültürü kapları, Harris Uni-Core doku korerleri, mikroörnek alma sırasında koronal beyin kesitlerinin EBSS ile oksijenlenmesi için gaz hortumlarına takılacak 200 μL RNase-free mikropipet uçları, kavisli makaslar, kuru buz ve doku toplama tüpleri dahil tüm ek malzemeleri hazırlayın. Tüpleri kuru buz üzerine yerleştirin.
2. Beynin çıkarılması ve koronal kesit alınması
- Fareyi bir DecapiCone içine yerleştirin ve kemirgen giyotini kullanarak başsız hale getirin. Başı DecapiCone'dan çıkarın ve düz bir yüzeye yerleştirin. Bir skalpel kullanarak, burun deliğinin yaklaşık 3 mm kaudalinden başlayarak kafatasının orta hattı boyunca deriyi kesin. Kraniyumu ve göz çukurlarını açığa çıkarmak için deri kapakçıklarını yanlara doğru soyun.
- Kavisli makas kullanarak, her iki optik siniri keserek gözle olan bağlantılarını koparın. Oksipital ve interparietal kemikleri dikkatlice kırıp dorsal parietal ve frontal kemikleri çıkararak kranial boşluğu açın. Olfaktör bulbları açığa çıkarmak için bir kemik rongeuru ile nazal ve lakrimal kemikleri kırın. Olfaktör bulbları rostral beyinden ayırmak için kavisli makas kullanın. Tüm beyni, hindbrain kısmı sağlam kalacak şekilde çıkarın. Beyni 60 x 15 mm boyutunda, RNase-free bir Cellstar hücre kültürü kabının üst kısmına yerleştirin. Doku örnekleme çalışma yüzeyine taşıyın.
- Ekli doku doğrayıcının (tissue chopper) filtre kağıdını EBSS ile dikkatlice nemlendirmek için RNase-free bir pipet kullanın. Beyin dokusunu EBSS ile ıslatın.
- Beyni doku doğrayıcıya aktarın ve uygun yönlendirmeyi ayarlayın. Not: Beyin, ventral yüzeyi filtre kağıdına yaslanacak şekilde konumlandırılmalıdır. Orta hat (interhemisferik fissür) doğrayıcı bıçağa dik olmalı ve beynin rostral kenarı bıçağa bitişik olmalıdır.
- Beyni sabit tutmak için DEPC işleminden geçmiş bir ressam fırçasıyla beynin dorsal yüzeyine hafifçe baskı uygulayın. Beyni sabit tutarken, bıçak tutucu kolu dorsal doku yüzeyinin yaklaşık 4-5 cm üzerinde kaldırın ve bu konumda tutun. Fırçayı beyin yüzeyinden çekin ve mikrometre kullanarak 750 μm ayarını yapın. Kolun düşmesine izin vererek dokuyu doğrayın ve 750 μm'lik bir koronal kesit oluşturun.
- Doğrayıcı bıçak sabitken, ressam fırçasıyla yuvarlama hareketi yaparak doku kesitini bıçak yüzeyinden nazikçe süpürün. Doku kesitini hemen petri kabındaki oksijenlendirilmiş EBSS içine yerleştirin. İkinci bir araştırmacı adım 3.1'e başlayabilir.
- Tüm rostro-kaudal düzlem boyunca seri beyin kesitleri elde edilene kadar 2.5 ve 2.6 numaralı adımları tekrarlayın.
3. Beyin bölgesi mikrodiseksiyonu
- Doku mikrodissection işlemi sırasında numune aydınlatmasının engellenmemesini sağlamak için ışıklandırmayı ayarlayın. Mikrodissection sırasında doku için tamponlanmış, oksijenle zenginleştirilmiş bir ortamı korumak amacıyla %95/%5 oranındaki O2/CO2 karışımının konumunu ve akışını ayarlayın.
- İlgilenilen bölgeyi içeren koronal beyin kesitini belirleyin. Bir resim fırçası kullanarak beyin kesitini petri kabının tabanına düz bir şekilde yerleştirin. Tablo 1 veya diğer referanslara dayanarak uygun çapta bir doku korer seçin. Koronal doku kesitini resim fırçasıyla sabit tutarken, doku korerin kesici ucunu doku kesitinin yüzeyine doğru indirin.
- Basınç uygulayarak doku korer ucunu doku kesitinden geçirin ve petri kabının tabanına sıkıca bastırın. İlgilenilen bölgenin çevre dokudan ayrıldığından emin olmak için dairesel bir döndürme hareketi uygulayın. Doku koreri dikkatlice doku kesitinden kaldırın ve mikro-punch'ı serbest bırakarak EBSS içinde yüzmesini sağlayın.
- Bir resim fırçası kullanarak, doku mikro-punch'ını derhal kuru buz üzerinde tutulan -80 °C'ye dayanıklı bir saklama tüpüne yerleştirin. Doku, tüpün kenarına kolayca yapışmalıdır. Mikro numune içeren tüpü kuru buza geri koyun.
- İlgilenilen her bir beyin bölgesi için 3.2 - 3.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
4. Doku arşivleme
- Mikrodissection işlemi tamamlandıktan sonra, her bir numune içeren TrakMates tüpünün ilgili barkodlarını kaydetmek için VisionMate tarayıcı sistemini kullanın. 96 bölmeli TrakMates tüp rafı doldurulduğunda, rafı hızlıca tarayın ve doku numunelerini RNA ekstraksiyonuna kadar hemen -80 °C bir dondurucuya yerleştirin.
5. Toplam RNA ekstraksiyonu
- RNaseZap kullanarak RNase-free bir çalışma alanı hazırlayın. MagMAX-96 Total RNA Isolation Protokolü10 içerisinde açıklandığı şekilde yeterli miktarda manyetik Bead Mix ve Lysis/Binding Solution hazırlayın.
- Doku örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve tüpleri doğrudan kuru buz üzerine yerleştirin.
- Örnek içeren bir TrakMates tüpüne 100 μL Lysis/Binding Solution ekleyin. Pellet karıştırıcıya nükleaz içermeyen 0,5 ml tüp boyutunda bir havan (pestle) takın ve dokuyu homojenleştirin. Düşük tutulumlu, nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak homojenleştirilmiş örneği yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğuna aktarın. Düşük tutulumlu, nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak örneğe hemen 60 μL %100 izopropanol ekleyin ve pipetle 3-4 kez aşağı yukarı çekerek karıştırın.
- Düşük tutulumlu, nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak örneğe 20 μL Bead Mix ekleyin. Pipetle 3-4 kez aşağı yukarı çekerek karıştırın.
- 5.3-5.4 adımlarını tüm doku örnekleri için tekrarlayın.
- Toplam RNA ekstraksiyonunu tamamlamak için MagMAX-96 Total RNA Isolation Protokolü'nün III.A.2 ile başlayan adımlarını izleyin. NOT: Ticari olarak mevcut başka manyetik boncuk destekli toplam RNA izolasyon kitleri bulunmaktadır; ancak bunlar bu çalışmada incelenmemiştir. İlgili ürünleri kullanarak toplam RNA izolasyonuyla ilgili ayrıntılar için lütfen üreticinin kit kılavuzlarına bakın.
- Elde edilen toplam RNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu NanoDrop 3300 spektrofotometre veya diğer düşük hacimli spektrofotometre/florometre teknolojilerini kullanarak ölçün.
6. Temsili Sonuçlar:
| Beyin Bölgesi/Çekirdek | Doku Biopsi Punch Çapı (mm) | Toplam RNA (ng/μL) | 260/280 Oranı |
| Frontal Korteks | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| Nucleus Accumbens | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| Striatum | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| Singulat Korteks | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| Hipotalamus - Paraventriküler Nukleus / Suprakiyazmatik Nukleus (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| Talamus | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| Hipotalamus - Dorsomedial Nukleus / Ventromedial Nukleus (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| Amigdala | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| Hippocampus - Ca 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| Hippocampus - Ca1/Dentate Gyrus | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| Periakveduktal Gri Cevher | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| Dorsal Raphe Nukleusu | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| Retiküler Formasyon | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
Tablo 1. Mikrodiseksiyonla ayrıştırılmış fare beyin bölgelerinin, ilgili optimal doku korer çapları, temsilci toplam RNA verimi ve saflığı ile birlikte numaralandırılması. Rostro-kaudal sırayla listelenen 13 mikrodisekte beyin bölgesi, boyut ve yönelim açısından farklılık gösterir. PVN/SCN mikropunch; anteromedial paraventriküler nukleusu, periventriküler nukleusun bölümlerini, sub-paraventriküler zonu ve diğer parvosellüler nöronları içerir. Talamus mikropunch, PVN/SCN mikropunch bölgesi ile aynı koronal planda yer alan anterior talamik nukleusları içerir. DMH/VMH mikropunch, dorsomedial nukleus ile ventromedial nukleus arasında yer alan aksesuar magnosellüler nukleusları ve diğer parvosellüler nöronları içerir. Amigdala örneği, hem merkezi hem de bazolateral alt bölgeleri kapsar. RNA verimi ve 260/280 oranları, her bir beyin bölgesinden elde edilen okumaları göstermek amacıyla ilgili mikrodiseksiyon örneklerinden elde edilen tekil değerlerdir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde dikkatli bir şekilde ele alınması ve değerlendirilmesi gereken birçok kritik adım bulunmaktadır. Her bir ilgili bölgenin çıkarılması için uygun doku delici çapının seçilmesi belirlenmelidir. Tablo 1'de sunulan doku delici çapları listelenen beyin bölgelerinin toplanması için uygun olsa da, her araştırmacı ilgili dokuların optimal şekilde toplanması için uygun boyutlu doku deliciyi belirlemelidir. İkinci olarak, bu yöntemde belirtilen koronal kesit kalınlığının (750 μm), çeşitli genetik arka planlara sahip y...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) ve Ordu Araştırma Ofisi (ARO) tarafından W911NF-10-1-006 ödül numarası ile finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Isotemp 102 benmari cihazı | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Laboratuvar rotatörü (orbital çalkalayıcı) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Pelet karıştırıcı | VWR international | 47747-370 | |
| RNaz içermeyen 0,5 mL havan eli | VWR international | KT749521-0590 | Nükleaz içermeyen |
| Dietil pirokarbonat (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Çift kenarlı jiletler | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–manuel mikrometreli doku dilimleyici | Stoelting Co. | 51425 | |
| 2/0 Yuvarlak resim fırçası’s fırçası | Princeton Sanat Fırçası | 4350R | |
| Harris Uni-Core doku biyopsi cihazı (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core doku biyopsi punch'ı (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core doku örnekleyici (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core doku örnekleme cihazı (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Giyotin | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiCones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’dengeli tuz çözeltisi (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| 25 mL pipetler | Corning | 4489 | Nükleaz içermeyen |
| epT.I.P.S. LoRetention Çift Filtreli pipet uçları, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Kapaklı TrakMates vidalı kapaklı tüpler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| VisionMate kablosuz 2D barkod okuyucu | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| VisionMate SR tekli raf 2D barkod okuyucu | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μL üniversal uyumlu pipet uçları | Corning | 4864 | Nükleaz içermeyen |
| Cellstar hücre kültürü kapları | Greiner Bio-One | 628160 | Nükleaz içermeyen |
| Greiner Bio-One 96 kuyucuklu polistiren Cellstar doku kültürü plağı, U-tabanlı | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Nükleaz içermeyen |
| #4 Filtre kağıdı | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Silikon ampul tipi güvenli pipet doldurucu | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 Spektrofotometre | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Kaynaklar
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
