Sinaptik Ko-Kültürlerde Ventral Hipokampal Aksonlar Boyunca Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyalinin Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Zhong, C., et al., Ventral Hipokampal Aksonlar Boyunca Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyallemesi ve Nörotransmitter Salınımının Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, fare ventral hipokampusundaki nikotinik asetilkolin reseptörlerinin nikotin aracılı aktivasyonunun aksonlar boyunca sürekli kalsiyum sinyalizasyonu ile nasıl sonuçlandığını göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Kalsiyum Görüntüleme

1. Kültürleri (5-7 gün in vitro olarak) normal HBS ile hızlı bir şekilde durulayın, daha sonra kültürleri 5 μM Fluo-4 Ca^{2 +} indikatörü (ester) ve% 0.02 Pluronic F-127 ile HBS'de (2 ml) 37 ° C'de 30 dakika boyunca yükleyin ve% 5 CO₂.
2. Fluo-4 solüsyonunu HBS ile yıkayın (3 kez / 5 dakika). Kültürleri en az 30 dakika inkübatöre (37 °C /% 5 CO₂) geri koyun.
3. Kültürleri (in vitro olarak 5-7 gün) bir görüntüleme odasında tutun ve odayı dönen bir disk konfokal mikroskobu üzerine monte edin. RT'de HBS kokteyli ile sürekli perfüz (1 ml / dak).
4. Plan-Apochromat objektif (1,4 NA ile 60X su, uyarma 488 nm, emisyon 530 nm) ve bir CCD kamera ile vHipp mikro dilimlerinden aksonal projeksiyonların Fluo-4 floresan görüntülerini toplayın.
5. Nikotin öncesi kontrol olarak temel Fluo-4 floresan görüntülerini (2 dakika boyunca her 10 saniyede bir) toplayın. 1 dakika boyunca hızlı perfüzyon (2 ml / dak) ile nikotin (1 μM) uygulayın, ardından nikotini bir HBS kokteyli ile yıkayın. 30 dakika boyunca her 10 saniyede bir nikotin uygulaması öncesinde, sırasında ve sonrasında hızlandırılmış görüntüler çekmeye devam edin.
6. Ham fluo-4 floresan görüntülerinin tüm karelerini kaydedin ve daha fazla analiz için bunları bir dizi TIFF görüntüsü olarak dışa aktarın.
7. Nikotin uygulamasından önce ve sonra vHipp aksonları boyunca fluo-4 floresansının entegre yoğunluğunu toplayın.
8. Entegre floresan yoğunluğunu aşağıdaki denklemle normalleştirin: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, burada F₀, arka plan düzeltmeli nikotin öncesi entegre floresan yoğunluğudur ve F, nikotin uygulamasından sonraki her zaman noktasında vHipp aksonları boyunca entegre floresan yoğunluğudur. Normalleştirilmiş entegre floresan yoğunluğunu analiz edin ve çizin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Canlı görüntüleme için HBS kokteyli pH=7.3
NaCl (Doğal)	Sigma	S9888 Serisi	135 milyon
Kartal	Sigma	P9333 Serisi	5 milyon
Magnezyum klorür	Sigma	M8266	1 milyon
Kalsiyum klorür	Sigma	C1016	2 milyon
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H3375	10 milyon
glikoz	Sigma	G0350500	10 milyon
Tetrodotoksin	Tocris (Türkçe)	1078	2 μM
Bikülin	Tocris (Türkçe)	131	10 μM
D-AP-5	Tocris (Türkçe)	105	50 μM
CNQX (Türkçe)	Tocris (Türkçe)	1045	20 μM
LY341495	Tocris (Türkçe)	1209	10 μM

Serisi Serisi Serisi Serisi Adet