Drosophila Fotoreseptörlerinde Uzun Süreli Depolarizan Afterpotential (PDA) Araştırılması

Özet

Kaynak: Gutorov, R., et al. Drosophila fotoreseptörlerinde fotopigment seviyelerini ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, beyaz gözlü Drosophila'da uzun süreli depolarize edici artpotansiyel (PDA) araştırmak için deneysel bir protokolü göstermektedir. Sineğin gözü, fotopigment rodopsini metarhodopsine dönüştürmek için yoğun mavi ışık darbelerine maruz bırakılır ve pozitif iyon kanallarını açan ve membran depolarizasyonuna neden olan bir sinyal kaskadı başlatır. Mavi ışık, metarhodopsinin rodopsine yeniden dönüşümünü önlediğinden, pozitif iyonların sürekli akışı, uzun süreli depolarize edici son potansiyel (PDA) olarak bilinen sürekli depolarizasyona neden olur.

Protokol

>1. Elektroretinogram kullanılarak uzun süreli depolarizan artpotansiyel (PDA) ölçümü

1. Drosophila melanogaster hazırlığı için uygun yetiştirme koşulları
   1. Raise D. melanogaster, 24 ° C sıcaklıkta ve 12 saatlik karanlık / aydınlık döngüde tutulan bir inkübatörde gıda içeren standart sarı mısır içeren şişelerde uçar.
   2. Sinek şişelerini deneyden en az 24 saat önce karanlıkta tutun.
2. Genel kurulum
   1. 1 mm x 0.58 mm (OD x ID) fiber dolgulu borosilikat cam kılcal damarları çekerek kayıt pipetlerini hazırlayın (Şekil 1L, O). Pipetlerin direnci 5-10 MΩ olmalıdır; Uygun herhangi bir çektirme kullanılabilir.
   2. Özel yapım 2 V güç kaynağına bağlı 3 M KCl çözeltisine 3 mm gümüş tel yerleştirerek iki gümüş kabloyu AgCl₅ ile kaplayın.
   3. Kaplanmış her bir gümüş teli elektrot tutucularına yerleştirin (Şekil 1N).
   4. Uzun uçlu bir şırınga kullanarak cam kılcal damarı filtrelenmiş Ringer solüsyonu ile doldurun (bkz. Tablo 1M).
   5. Tel elektrodu cam kılcal damara yerleştirin. Kılcal damar içindeki solüsyonun gümüş tel ile temas halinde olduğundan emin olun.
   6. Elektrot tutucuları (Şekil 2P, N) iki elektrot mikromanipülatörüne (Şekil 2G) yerleştirin.
3. Sineği elektrik kayıtları için hazırlama prosedürü
   NOT: Sineği karanlığa uyarlanmış koşullar altında tutmak için, aşağıdaki adımlar sırasında yalnızca loş kırmızı ışık aydınlatması kullanın.
   1. Şişe içindeki sinekleri sinek uyutma sistemini kullanarak CO₂ gazı ile uyuşturun (Şekil 1A, B) ve bunları uyuyan kaba dökün.
   2. Bir sinek seçin ve keskin bir cımbız kullanarak kanadından dikkatlice tutun. Sineklerin geri kalanını bir Petri kabı ile örtün.
   3. Sineği sinek tutucunun üzerine, sırtı ele bakacak şekilde yan yatacak şekilde uygun yönde yerleştirin (Şekil 1P).
   4. Havya güç kaynağını AÇIN. Akımı ~2.25 A olarak ayarlayın. Bu akım, 0.25 mm platin-iridyum filamenti ~55-56 °C'ye ısıtmalıdır.
   5. Havya üzerine düşük erime sıcaklığına (~55-56 °C) sahip bir damla balmumu yerleştirin (Şekil 1F).
   6. Cımbız kullanarak sineği kanatlarından kaldırın ve havya kullanarak kanatlarını sinek tutucuya (Şekil 1I) sabitleyin.
   7. Havya kullanarak, sineğin sırtını balmumu ile stand yüzeyine bağlayın (Şekil 1P).
   8. Havya ucunu bacakların birleşme noktasına indirin ve tüm bacakları bir araya getirecek şekilde balmumu eritin (Şekil 1P).
   9. Boyun bölgesinde baş ile sırt arasına küçük bir damla balmumu damlatın (Şekil 1P).
      NOT: Sinek kafasının aşırı ısınmasını önlemek için özel dikkat gösterin. Sineğin düzgün bir şekilde sabitlendiğinden ve deney sırasında hareket edemediğinden emin olun; Küçük hareketler kayıtlarda artefaktlar oluşturabilir. Göğüs ve karın bölgesindeki trakea açıklıklarının (solunum girişleri) balmumu ile kapatılmadığından emin olun.
   10. Sinek tutucuyu (Şekil 2Q) bir mıknatıs bloğu (Şekil 2I) üzerindeki karanlık bir Faraday kafesine yerleştirin ve sineğin ışık kılavuzunun ucundan ~5 mm uzakta olduğundan emin olun (Şekil 2L).
   11. Mikromanipülatörleri kullanarak kayıt elektrodunu (Şekil 2P) sineğin gözünün üzerine ve toprak elektrodunu (Şekil 2N) sineğin üst sırtının üzerine yerleştirin.
   12. Mikromanipülatörleri kullanarak toprak elektrodunu sineğin arkasına yerleştirin.
   13. Kayıt elektrodunu, tercihen mikromanipülatörler kullanarak sineğin gözünün dış çevresine yerleştirin.
       not: Elektrot göze yerleştirildikten sonra küçük bir çukur gözlenecektir; Gamze kaybolana kadar elektrodu gözden çıkarmadan yukarı doğru çekin. Elektrotlar ayrıca gövdeye ve göze uygulanan küçük elektrot jölesi damlacıklarına daldırılabilir.
4. PDA protokolü (bu protokol sadece beyaz gözlü sineklerde uygulanabilir)
   1. Turuncu bir filtre (maksimum fotopigmenti R durumuna dönüştürmek için 590 kenar filtresi) kullanarak maksimum yoğunlukta 5 s'lik bir ışık darbesi verin.
   2. Turuncu filtreyi geniş bantlı mavi (BP450/40 nm) bir filtreyle değiştirin ve maksimum yoğunlukta üç adet 5 sn ışık darbesi verin.
      NOT: Sabit bir durum voltaj tepkisine ulaşılana kadar uzun sürekli maksimum yoğunlukta mavi ışık darbesi vermek de mümkündür.
   3. Karanlıkta 60 saniye bekleyin, mavi filtreyi önceki turuncu filtreyle değiştirin ve 5 saniye aralıklarla iki adet 60 sn ışık darbesi verin.

Tablo 1: Ringer çözümünün bileşimi

Ringer'ın çözümü
reaktif	Konsantrasyon (mM)
NaCl (Doğal)	130
Kartal	2
MgCl2	5
CaCl2	2
HEPES ÜNİVERSİTESİ	10
NaOH ve HCl kullanılarak 7,15'e kadar pH titrasyonu

Sonuçlar

Şekil 1: Sinek fiksasyonu ve pipet hazırlığının kaydedilmesi için gerekli aletler ve cihazlar. (A) Sinek travers sistemi; (B) Fly sleeper sistem pedalı; (C) Soğuk ışık kaynağı; (D) Stereoskopik mikroskop; (E) Balmumu filament ısıtıcı; (F) Havya; (G) Balmumu filament ısıtıcı pedalı; (H) Kaba cımbız; (I) Manyetik sinek standı; (J) Düşük erime sıcaklığı balmumu; (K) Hassas mendiller; (L) Dikey pipet çekt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Uzun uçlu 1 mL şırınga			Şekil 1M
1 kaba cımbız		Dumont #5, Standart	0,1 mm x 0,06 mm, uzunluk 110 mm, Inox (Şekil 1H)
2 kondansatör merceği
A/D dönüştürücü	Moleküler Cihaz	Dijital veri 1200	Olası değiştirme: moleküler cihazlardan gelen herhangi bir dijital veri (örneğin 1440A) - Şekil 2C
yükselteç	Neredeyse mükemmel elektronikler		Olası değiştirme: Warner cihazları - IE251A veya IE-210 (headstage ile birlikte gelir) - Şekil 2D
Titreşim Önleyici Tablo	Newport	VW-3036-ISTEĞE BAĞ-01	Şekil 7H
Kapil	Harvard Aygıtı	Borosilikat cam kılcal damarlar	1 mm x 0,58 mm (Şekil 1O)
Kelepçe	Moleküler Cihaz		yazılım
CO2 tankı
Soğuk ışık kaynağı	Schott	KL1500 LCD	Şekil 1C
Hassas silecekler	Kimtech A.Ş.		Kimwipes (Şekil 1K)
Elektrot tutucu			Kılcal OD 1 mm için uygundur (Şekil 1N, Şekil 2N ve Şekil 2P)
Faraday kafesi	Ev yapımı		Elektromanyetik gürültü koruması ve siyah ön perde (Şekil 2K)
Filtre (Renk)	Schott	OG590, Kenar filtresi	Şekil 2S
Filtre (Renk)	Schott	BP450/40 deniz mili	Şekil 2S
Filtre (Renk)	Blazers	550 deniz mili	Şekil 2S
Soğuk ışık kaynağı için filtre (Renk)	Schott	RG630	Şekil 1C
Filtre (Isı)	Schott	KG3	Şekil 1S
Filtreler (Nötr yoğunluk filtresi)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Şekil 2S
Flaş Lambası sistemi	Honeywell		Şekil 2U
Enjektörlü sinek travers sistemi	Enjekte + matik		Şekil 1A-B
Lamba güç kaynağı	Ptı	LPS-220	Şekil 2W
Işık dedektörü	Ev yapımı		Fototransistör (Şekil 2O)
Işık kılavuzu			3 mm çap, 1,3 m uzunluk (Şekil 2L,M)
ışık kaynağı			Yüksek basınçlı ozonsuz 75 W Xenon lamba (50 W ile çalışır), olası değiştirme: Cairn research- OptoLED (Şekil 7R)
Düşük sıcaklıkta eriyen balmumu	Ev yapımı		~55– 56 °C erime sıcaklığına ulaşmak için ~3:1'de balmumu (Tm≈62 °C) ve parafin karışımından oluşur (Şekil 6J)
Sinekler için manyetik stand	Ev yapımı		Şekil 1I ve Şekil 2Q
Kafa aşamalı mikroelektrot ön yükseltici sistemi	Neredeyse mükemmel elektronikler		Empedans test cihazı (Şekil 2G)
Mikromanipülatör (mekanik kaba)	Tritech Araştırma, Narishige	M-2
Mikromanipülatör (mekanik ince)	Leitz Mikro Sistemler	Leitz Mekanik Mikromanipülatör	Şekil 2F
pCLAMP	Moleküler Cihaz		yazılım
Petri kabı			60 Milimetre
Darbe üreteci	AMPI (Ampi)	Yüksek Lisans 8	Şekil 2A
Elektrokardiyografi için Redux krem	Parker Laboratuvarları	Redux Elektrolit Krem
Deklanşör sürücüsü	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Tek Kanallı Tek Kararlı	Şekil 2V
Kepenk sistemi	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Tek Kararlı Kepenkler	Şekil 2V
Gümüş Tel	Warner Enstrümanları		0,25–1 mm çap, klorlanması gerekiyor
Platin-iridyum filamentinden oluşan havya			0,25 mm çap (Şekil 2F)
Stereoskopik zoom Mikroskobu	Nikon	SMZ-2B	Şekil 1D
Stereoskopik zoom Mikroskobu	vahşi	Vahşi M5	6, 12, 25 ve 50 büyütme ayarıyla (Şekil 2E)
Şırınga filtreleri	Millex Tekstil		22 μm PVDF filtresi
Dikey pipet çektirme	Sutter/ Narishige	Modeli: P-97/PP-830	Tercih ettiğiniz gibi dikey veya yatay çektirme kullanın (Şekil 1L)
Balmumu filament ısıtıcı	Ev yapımı		Şekil 1E-G
Xenon Flaş Lamba sistemi	Dr. Rapp OptoElektronik	JML-C2	Şekil 2X

Ekran Serisi Serisi Serisi Serisi