Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

Özet

Kaynak: Bosch, D., et al. Beyin Dilimlerinde Korku Devrelerinin Ex Vivo Optogenetik Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, farelerden alınan akut amigdala beyin dilimleri kullanılarak medial prefrontal korteks (mPFC) ve amigdala nöronları arasındaki sinaptik bağlantıyı analiz etmek için bir prosedürü göstermektedir. Bu farelerdeki mPFC nöronları, bir floresan proteine kaynaşmış channelrhodopsin eksprese eder. Channelrhodopsinler, ışık aktivasyonu üzerine mPFC nöronlarında iyon akışını ve aksiyon potansiyeli oluşumunu kolaylaştırır. Sonuç olarak, mPFC nöronları, postsinaptik amigdala nöronlarına bağlanan nörotransmiterleri serbest bırakır ve mPFC-amigdala bağlantısını görselleştirmek için kaydedilen postsinaptik akımları tetikler.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Presinaptik Liflerin Görselleştirilmesi ve Uyarılması

1. Liflerin ve hücrelerin optogenetik aktivasyonu için yama mikroskobu hazırlayın:
   1. Monte edilmiş ışık yayan diyotu (LED) ışık dağıtım yoluna ortalayın.
   2. Arka odak düzleminde ve her bir objektifin çıkışında LED ışık yoğunluğunu bir güç ölçer ile ölçün ve 470 nm'lik uygun dalga boyunu seçin.
   3. Işık yoğunluğunu mW/mm² cinsinden hesaplayın ve 470 nm dalga boyu için ölçülen değerler için her hedef için bir kalibrasyon eğrisi (LED yoğunluğu (%) ve ışık çıkışı (mW/mm²)) oluşturun.
2. Arayüz odasından bir akut amigdala dilimi alın ve bir floresan lamba ile donatılmış dik mikroskoba monte edilmiş dilim odasına yerleştirin. Dilimi, arabirim bölmesinde yukarı bakan dilim yüzeyi kayıt odasında da yukarı bakacak şekilde konumlandırmaya dikkat edin. ~31 °C sıcaklıkta 1 - 2 ml/dk hızında taze, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile perfüz dilimi.
3. Floresan lambayı, eksprese edilen spesifik floresan proteini için uygun filtre setleri ile birlikte kullanarak dilimdeki presinaptik lifleri gözlemleyin. Genel bir bakış elde etmek için 5x objektif (Şekil 1E) ve hedef alandaki elyaf yoğunluğunun değerlendirilmesi için 60x objektif kullanın.
   Not: GFP ve YFP için, malzemeler/ekipman tablosunda belirtildiği gibi "yeşil" Filtre seti (Uyarma 472/20, Işın Ayırıcı 495, Emisyon 490 LP) için mCherry kullanım filtre seti "kırmızı" (Uyarma 560/40, Işın Ayırıcı 585, Emisyon 630/70) kullanın.
4. Mikroskop ışık yolundaki açıklığı deney için istenildiği gibi açın veya kısıtlayın (Şekil 2D).
5. Bir yama kaydı elde etmek için, bir yama pipetini dahili solüsyonla doldurun ve elektrot tutucusuna monte edin. Yama pipetine pozitif basınç uygulayın ve önce banyo solüsyonuna yavaşça indirin ve ardından mikromanipülatörü kullanarak görsel kontrol altında dilime indirin.
   1. Yama pipeti ile ilgilenilen nörona yandan ve üstten yaklaşın. Pipet hücrenin yüzeyindeyken (hücre yüzeyinde görünen çukur) pozitif basıncı serbest bırakın ve negatif basınç uygulayarak bir "gigaseal" elde edin.
   2. Tüm hücre kaydını elde etmek için zar yamasını yırtmak için daha fazla emme uygulayın. Daha sonra, hücreden gelen elektriksel tepkileri kaydederken channelrhodopsin'i (ChR) (470 nm) aktive etmek için uygun dalga boyunu kullanarak etiketli fiberleri bağlı LED ile uyarın.
   3. Sinaptik stimülasyon için düşük bir LED yoğunluğu ile başlayın ve istenen sinaptik akım genliğine ulaşılana kadar artırın. Zamanlamayı ve darbe uzunluğunu kontrol etmek için veri toplama yazılımındaki dijital çıkışları yapılandırarak LED'i tetikleyin (Şekil 3'teki örnekler).
      Not: LED'i tetiklemek için başka yazılımlar ve/veya TTL üreten cihazlar kullanılabilir.
6. Bir sonraki kaydedilen hücre için ve/veya spesifik ilaçların varlığında mikroskop ışık yolunda açık veya kısıtlı açıklık (adım 1.4) ile stimülasyonu tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1. stereotaktik enjeksiyonlar, akut beyin dilimlerinin hazırlanması ve presinaptik liflerin görselleştirilmesi. (A, B) Stereotaktik virüs enjeksiyonu. A) Kafatası açıkta ve enjeksiyon pipeti ile stereotaktik bir çerçeveye yerleştirilmiş anestezi uygulanmış farenin resmi. İç: Hızlı yeşil ile karıştırılmış virüs çözeltisi ile doldurulmuş enjeksiyon pipetinin resmini yakınlaştırın....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF)	Kompozisyon için referans #16 ve #23'e bakınız
Dahili yama çözümleri	Kompozisyon için referans #16 ve #23'e bakınız
Magnezyum Sülfat Heptahidrat	Roth, Almanya	P027.1	Arıtılmış suda 2M stok çözeltisi hazırlayın
stereoskop, SZX2-RFA16	Olimpos, Japonya
Xcite floresan lamba (XI120Q-1492)	Lümen Dinamiği Grubu, Kanada	2012-12699
Yama mikroskobu, BX51WI	Olimpos, Japonya
Multiclamp 700B yama amplifikatörü	Moleküler Cihazlar, ABD
Dijital veri 1440A	Moleküler Cihazlar, ABD
PClamp yazılımı, Sürüm 10	Moleküler Cihazlar, ABD		veri toplama ve stimülasyonu kontrol etmek için kullanılır
Banyo sıcaklık kontrol cihazı, TC05	Luigs & Neumann, Almanya	200-100 500 0145
Üç eksenli mikromanipülatör Mini 25	Luigs & Neumann, Almanya	210-100 000 0010
Mikromanipülatör denetleyici SM7	Luigs & Neumann, Almanya	200-100 900 7311
Yama pipetleri için cam kılcal damarlar	Dünya Hassas Aletler, Almanya	GB150F-8P
Arayüz odası için selüloz nitrat filtre kağıdı	Satorius Stedim Biyoteknoloji, Almanya	13006--50----ACN
LED ünitesi, CoolLED pE	CoolLED, Birleşik Krallık	244-1400	CoolLED veya USL 70/470 ve uygun adaptörler, LED stimülasyonu için iki alternatif seçenektir
CoolLED 100 Çift Uyarlama	CoolLED, Birleşik Krallık	pE-ADAPTÖR-50E
LED ünitesi, USL 70/470	Rapp Optoelektronik	L70-000
Çift bağlantı noktalı adaptör	Rapp Optoelektronik	Şirket ile Sorgulama
Filtre seti kırmızı (uyarma)	AHF, Almanya	F49-560	Filtreler F46-008 seti olarak satın alınabilir
(ışın ayırıcı)	AHF, Almanya	F48-585
(emisyon)	AHF, Almanya	F47-630
Filtre seti yeşil (uyarma)	AHF, Almanya	F39-472	Alternatifler: F36-149 veya F46-002 filtre seti (bant geçiren emisyon ile)
(ışın ayırıcı)	AHF, Almanya	F43-495W
(emisyon)	AHF, Almanya	F76-490
LaserCheck, el tipi güç ölçer	Tutarlı, ABD	1098293
IgorPro Yazılımı, Sürüm 6	Wavemetrics, Amerika Birleşik Devletleri		Elektrofizyoloji veri analizi için diğer alternatif yazılım paketleri de kullanılabilir
IgorPro için nöromatik makro paketi	http://www.neuromatic.thinkrandom.com

arası Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi