Bir Sıçanda Elektroretinogram ve Görsel Uyarılmış Potansiyelin Kaydedilmesi

Özet

Kaynak: Charng, J. et al. Bilinçli Sıçanlarda Kablosuz Elektroretinogram ve Görsel Uyarılmış Potansiyelin İmplantasyonu ve Kaydı. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, bilinçli bir sıçanda elektroretinogram (ERG) ve görsel uyarılmış potansiyelin (VEP) nasıl kaydedileceğini gösterir. Cerrahi olarak implante edilen elektrotlara sahip sıçan önce karanlığa adapte edilir. Dilatasyon damlaları uygulandıktan sonra, hayvan bir kısıtlayıcıya yerleştirilir ve bir Ganzfeld kasesine yerleştirilir. ERG ve VEP sinyalleri daha sonra kaydedilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Elektrotların Hazırlanması

Not: Cerrahi implantasyon için üç kanallı bir verici kullanılır, bu da 2 elektroretinogram (ERG) ve 1 görsel uyarılmış potansiyel (VEP) kaydının aynı anda yapılmasını sağlar. Üç aktif ve üç aktif olmayan elektrotun göze takılması için implantasyondan önce bir halka şeklinde önceden şekillendirilmesi gerekir. Tanımlama amacıyla, üretici aktif elektrotları yarı beyaz, yarı renkli plastik kılıflar içine alırken, aktif olmayan elektrotlar tam renkli kılıflarla kaplanmıştır. Toprak elektrodu (şeffaf plastik kılıf), 1.1, 1.2, 1.3 ve 1.7 adımlarını gerçekleştirmek için tüm aktif ve aktif olmayan elektrotlar için değiştirilmeden bırakılır.

1. Çift telli paslanmaz çelik elektrodu iki ince uçlu pense ile açın.
2. Paslanmaz çelik tellerden birini (uçtan yaklaşık 1 cm uzakta) kesin ve halka elektrodu şekillendirmek için tek bir uzun düz tel bırakın.
3. Tek paslanmaz çelik teli kendi üzerine katlayın ve elektrotun ucunda pürüzsüz bir halka oluşturacak şekilde bükün.
4. ERG aktif elektrotları için, ilmeğin tabanını bükerek bu halkayı ~ 0,2 - 0,5 mm çapında şekillendirin (burada açıklanan amaç için, her iki gözden ERG'yi kaydetmek için iki aktif elektrotu bu şekilde şekillendirin) ve ERG inaktif ve VEP elektrotları için döngü çapını ~ 0,8 mm çapında yapın (bu örnekte, bunu bir aktif VEP elektrodu ve üç aktif olmayan elektrotun tümü için yapın).
5. Dairesel VEP aktif elektrodu, elektrot vida başına dayanacak şekilde paslanmaz çelik bir vidanın (çap 0,7 mm, uzunluk 3 mm) etrafına asın.
6. Aktif olmayan 3 elektrotu (2 ERG, 1 VEP) ikinci bir paslanmaz çelik vidanın (çap 0.7 mm, uzunluk 3 mm) etrafına asın.
7. Tahrişi azaltmak için plastik kılıfı iki paslanmaz çelik telin keskin uçları üzerinden öne doğru çekin.
8. Telemetri vericilerini yaklaşık 25 °C'de 10 saatten fazla %2 glutaraldehit içinde bekleterek sterilize edin. Ardından, vericiyi üç kez steril tuzlu su ile durulayın.

2. Verici İmplantasyonu

1. Hayvan Hazırlama
   1. Deneyden önce cerrahi alanı %70 etanol ile temizleyerek dezenfekte edin. Kullanmadan önce tüm cerrahi ekipmanı otoklavlayın ve ameliyat sırasında kullanılmadığı zaman ekipmanı klorheksidin içinde tutun. Steril bir ortam sağlamak için ameliyat sırasında hayvanı cerrahi bir örtü ile örtün. Tüm deneycilerin cerrahi maskeler, steril eldivenler ve önlükler giydiğinden emin olun.
   2. 3 L / dk'lık bir akış hızında% 1.5 - 2 izofluran ile anesteziyi indükleyin ve ameliyat boyunca 2 L / dk'da% 1.5 - 2'de tutulun. Kası ayak parmakları arasında sıkıştırdıktan sonra pedal refleksinin olmaması nedeniyle yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
   3. Kasıkların üstünden sternuma kadar karın üzerinde 40 mm x 30 mm'lik bir alanı tıraş edin.
   4. Alnın üzerinde, gözlerin arkasında ve kulakların önünde 30 mm x 20 mm'lik bir alanı tıraş edin.
   5. Traş edilmiş iki alanı dezenfekte edin. Alın bölgesi için üç kez% 10 povidon-iyot ile dezenfekte edin (Cerrahi Teknologlar Derneği tarafından belirlenen Uygulama Standardı ile tutarlı olarak, göze yakın alan için alkol bazlı antiseptiklerin kullanımından kaçının). Karın üzerinde% 10 povidon-iyot ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.
   6. Ek topikal anestezi için korneaya 1 damla proxymetakain uygulayın.
   7. Gözlerin kurumasını önlemek için korneaya 1 damla karboksimetilselüloz sodyum uygulayın.
2. Cerrahi implantasyon
   1. Cerrahi bir neşter ile kulaklar arasındaki dikey orta hat boyunca kafaya 10 mm'lik bir kesi yapın.
   2. Sternumun altındaki orta hat boyunca cilt tabakasından karın üzerinde 5 mm'lik bir kesi yapın.
   3. Karın kesisinden baş kesisine kadar 5 mm çapında bir kanülü deri altından tünelleyin.
   4. Vericinin elektrot tellerini (3 aktif ve 3 aktif değil) kanül aracılığıyla karın bölgesinden başa doğru besleyin.
   5. Referans elektrodu verici tabanıyla birlikte bırakın ve elektrot ucunu aseptik gazlı bezle kapatın.
   6. Elektrot uçlarını (3 aktif ve 3 aktif değil) aseptik gazlı bezle kapatın.
   7. Farenin kafasını stereotaksik bir platforma sabitleyin.
   8. Alın kesisini cerrahi makasla 30 mm uzunluğa kadar uzatın.
   9. Gevşek cildi ~ 3 ve 9 pozisyonlarında 2 dikişle (3 - 0) geri çekerek cerrahi alanı ortaya çıkarın.
   10. Bregma, lambda ve orta hat dikişlerini ortaya çıkarmak için sterilize gazlı bez kullanarak kafatasının üzerindeki periosteuumu kazıyın.
   11. VEP aktif (7 mm ventralden bregmaya, 3 mm lateral ila orta hat) ve inaktif (5 mm rostral ila orta hatta bregma) stereotaksik koordinatlarda kafatası boyunca iki delik açın.
   12. VEP aktif ve aktif olmayan elektrotları önceden takılmış paslanmaz çelik vidalarla (çap 0,7 mm, uzunluk 3 mm) küçük bir tornavidayla önceden yapılmış deliklere ~ 1 mm derinliğe kadar kafatasına takın. Bu, alttaki kortikal dokuya zarar vermeden vidayı kemiğe sabitler.
   13. ERG aktif elektrotlarını implante etmek için, üst göz kapağını geçici olarak geri çekmek için 8 - 0 sütür kullanın.
   14. 16 ila 21 G'lik bir kanülü gözün arkasından deri altından üst konjonktival fornikse yerleştirin.
   15. Kılavuz iğneyi çıkarın.
   16. Aktif elektrodu kısaltılmış plastik kateterden alından göze doğru besleyin. Ardından plastik kateteri çıkarın.
   17. Elektrotun tünele geri çekilmesini önlemek için elektrot halkasından geçirilen geçici bir sütür (8 - 0) kullanın.
   18. Üst konjonktiva üzerinde saat 12 konumunda, limbusun 1 mm arkasında 0,5 mm'lik bir kesi yapın. Altta yatan sklerayı ortaya çıkarmak için künt diseksiyon kullanın.
   19. Limbusun hemen arkasına yarım skleral kalınlıkta 8 - 0 veya 9 - 0 şeklinde bir dikiş implante edin.
   20. ERG aktif elektrottan geçici sütürü çıkarın.
   21. Elektrot ucunun limbusa yakın olduğundan emin olarak, art arda 3 düğüm bağlayarak ERG aktif elektrodunu yarım skleral kalınlıktaki sütürüne sabitleyin.
   22. Konjonktival flebi 1 ila 2 kesintili sütür (8 - 0 ila 9 - 0) kullanarak kapatın. Konforu artırmak için konjonktivanın ERG elektrodunu tamamen kapladığından emin olun.
   23. Göz kapağı geri çekme dikişini çıkarın.
   24. Kontralateral göz için prosedürü tekrarlayın.
   25. Tüm paslanmaz vidaları ve elektrot tellerini sabitlemek için kafatasının üzerine siyanoakrilat jel sürün. Göz hareketlerini etkinleştirmek için sabitlemeden önce ERG aktif elektrotlarının çok sıkı çekilmediğinden emin olun.
   26. Kafa yarasını emilmeyen 3 - 0 dikiş kullanarak kapatın.
   27. Karın bölgesini ortaya çıkarmak için kemirgeni döndürün. Abdominal dermal insizyonu cerrahi makasla Linea alba boyunca 40 mm'ye kadar uzatın.
   28. İç karın boşluğunu ortaya çıkarmak için iç kas duvarından 35 mm'lik bir kesi yapın.
   29. İki dikiş (3 - 0) kullanılarak, verici gövdesi hayvanın sağ tarafındaki iç karın duvarına tutturulur. Karaciğerle temastan kaçının.
   30. Toprak elektrodunu halka ve bu şekilde bir sütür (3 - 0) ile sabitleyin. Ardından, karın boşluğuna serbest yüzer şekilde yerleştirin.
   31. Sürekli bir sütür (3 - 0) kullanarak peritonu kapatın.
   32. Kesintili dikişler kullanarak cilt kesisini kapatın (3 - 0).
3. Ameliyat sonrası bakım
   1. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı izleyin. Ameliyattan sonra hayvanı tek başına barındırın.
   2. Carprofen'i 4 gün boyunca günde bir kez analjezi (5 mg / kg) için deri altından uygulayın.
   3. Ameliyat sonrası 7 gün boyunca içme suyuna profilaktik oral antibiyotikler (Enrofloxin, 5 mg / kg) ekleyin.
   4. Ameliyattan sonraki ilk 7 gün tahrişi azaltmak için cilt kesi bölgelerine anti-inflamatuar bir merhem sürün.

3. Bilinçli Sıçanlarda ERG ve VEP Kayıtları Yapın

1. ERG ve VEP kayıtlarından önce 12 saat boyunca hayvanı karanlıkta adapte edin.
2. Tüm deneysel manipülasyonları loş kırmızı aydınlatma altında gerçekleştirin (17.4 cd.m-2, λmax = 600 nm)
3. Korneaya topikal anestezi (%0.5 proxymetakain) ve dilatasyon (%0.5 tropikamid) damlaları uygulayın.
4. Bilinçli kemirgeni ısmarlama, şeffaf bir kısıtlayıcıya yönlendirin.
   not: Bu plastik tüpün uzunluğu, toplam çapı 60 mm'de sabitlenmiş olarak, farklı büyüklükteki sıçanları barındıracak şekilde ayarlanabilir. Cihazın ön ucu, kafa hareketini en aza indirmek için sivriltilmiştir ve normal nefes almayı sağlamak için delikler içerir. Bu konik cephe, farenin kafasının ve gözlerinin Ganzfeld küresinin açıklığına hizalanmasına ve stabilizasyonuna izin verir. Kemirgenin ameliyattan önce kısıtlayıcıya (3 ila 5 kez) alıştırıldığını unutmayın.
5. Kemirgeni, gözleri kasenin açıklığı ile aynı hizada olacak şekilde Ganzfeld kasesinin önüne yerleştirin.
6. ~ 5 cm yakınından bir mıknatıs geçirerek kalıcı vericiyi açın. Ardından, alıcı tabanındaki LED durum ışığını kontrol ederek vericinin açık olduğunu doğrulayın.
7. Bir dizi ışık enerjisi üzerinden sinyalleri toplayın (yani, -5.6 ila 1.52 log cd.s.m²).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyoamplifikatör	Ekipmanlar	ML 135	ERG ve VEP sinyallerini güçlendirir
Karboksimetilselüloz sodyum %1.0	Alerji	CAS 0009000-11-7	Ameliyat sırasında kornea hidrasyonunu koruyun
Carprofen %0.5	Pfizer Hayvan Sağlığı Grubu	CAS 53716-49-7	Sıvı ikmali için enjekte edilebilir salin ile verilen ameliyat sonrası analjezi
Klorheksadin %0,5	Orion Laboratuvarları	27411, 80085	Cerrahi aletin dezenfeksiyonu
Siyanoakrilat jel aktivatörü	RS bileşenleri	473-439	Siyanoakrilat jeli hızla kurur
Siyanokrilat jel	RS bileşenleri	473-423	Paslanmaz vidaları kafatasına sabitleyin
Diş çapağı	Storz Enstrümanları, Bausch ve Lomb	E0824A	VEP vidalarını implante etmek için her yarım küre üzerinde kafatasında küçük bir delik açmak için ~ 0,7 mm çapında minyatür matkap kafası
alıştırma	Bosch	Dremel 300 serisi	Trepanning için otomatik matkap
Enrofloksin	Troya Laboratuvarları		Ameliyat sonrası profilaktik antibiyotik
Ganzfeld entegre küre	Fotometrik Çözümler Uluslararası		Özel tasarlanmış ışık stimülatörü: 36 mm çap, 13 cm açıklık boyutu
Gazlı bez çubukları	Multigate Tıbbi Ürünler Ticaret A.Ş.	57-100B	Ameliyat sırasında cerrahi kesiyi ve açıkta kalan kafatası yüzeyini kurutur
İzofluran% 99.9	Abbott Avustralasya Ticaret Ltd. Şti	CAS 26675-46-7	Özel Adı: Isoflo (TM) İnhalasyon anestezisi. VEP elektrot implant cerrahisi için oksijen gazı ile karıştırılmış farmasötik dereceli inhalasyon anestezisi
Kenacomb merhem	Aspen İlaç Ticaret Ltd. Şti.		Ameliyat sonrası cilt tahrişini ve kaşıntıyı azaltmak için
Lüks LED'ler	Phillips Aydınlatma A.Ş.		Işık stimülasyonu için, Scope yazılımı tarafından kontrol edilen yirmi adet 5 watt ve bir adet 1 watt LED
İğne (makrocerrahi)	Dünya Hassas Aletler	501959	Karın ve baş cerrahisinin dikilmesi için, 3-0 dikiş, göz iğnesi, kesme kenarı 5/16 daire Boyut 1, 15mm
İğne tutucu (makrocerrahi)	Dünya Hassas Aletler	500224	Karın ve kafa ameliyatı sırasında iğne tutmak için
İğne tutucu (mikrocerrahi)	Dünya Hassas Aletler	555419NT	Oküler cerrahi sırasında iğne tutmak için
Optiva kateter	Smiths Medikal Uluslararası Ltd	16 veya 21 G	Kornea aktif elektrotlarını kafatasından konjonktivaya yönlendirin
Povidon iyot %10	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Tescilli adı: Betadine, Traş edilmiş cildi ameliyata hazırlamak için antiseptik %10, 500 mL
Powerlab veri toplama sistemi	Ekipmanlar	ML 785	Telemetri veri dönüştürücüsü ile eşleştirilmiş telemetri vericisinden sinyal alın
Proxymetakain% 0.5	Alcon Laboratuvarları	CAS 5875-06-9	Topikal oküler analjezi
Kısıtlayıcı	Cutom Yapımı		Tutucunun önü, kafa hareketini en aza indirmek için koniktir, uzunluk farklı sıçan uzunluklarına uyacak şekilde ayarlanabilir, toplam çap 60 mm'dir.
Scapel bıçağı	R.G. Tıbbi Malzemeler	SNSM0206	Cerrahi insizyon için
Makas (makrocerrahi)	Dünya Hassas Aletler	501225	Abodmen ve forhead üzerinde doku kesmek için
Makas (mikrocerrahi)	Dünya Hassas Aletler	501232	Elektrot bağlantısı için konjonktivayı incelemek için
Kapsam Yazılımı	Ekipmanlar	Sürüm 3.7.6	ADI Powerlab sistemi aracılığıyla uyaranı eş zamanlı olarak tetikler ve veri toplar
Tıraş makinesi	Oster	Altın A5	Cerrahi bölgelerden kürk tıraş edin
Paslanmaz makara vidaları	Mikro Bağlantı Elemanları	L001.003CS304	0,7 mm şaft çapı, 3 mm uzunluk
Stereotaksik çerçeve	David Kopf ·	Model 900	Kafatasındaki implantasyon işaretlerini bulmak için küçük bir hayvan stereotaksik aleti
Cerrahi örtü	Hayati Tıbbi Malzemeler	GM29-612EE	Ameliyat sırasında steril bir ortam sağlayın
Sütür (makrocerrahi)	Ninbo tıbbi iğneler	3-0	karın ve baş cerrahisinin dikilmesi için, steril ipek örgülü, 60cm
Dikiş iğnesi (mikrocerrahi)	Ninbo tıbbi iğneler	8-0 veya 9-0	skleraya elektrot dikme ve konjonktival yaranın kapatılması dahil olmak üzere oküler cerrahi için, naylon sütür, 3/8 daire 1×5, 30cm
Telemetri veri dönüştürücüsü	Veri Bilimleri Uluslararası	R08	Telemetri sinyalinin veri toplama yazılımı ile arayüz oluşturmasına izin verir
Telemetri Veri Değişim Matrisi	Veri Bilimleri Uluslararası		Vericilerden veri toplar, alıcı ile eşleştirir
Telemetri veri alıcısı	Veri Bilimleri Uluslararası	RPC-1	Vericiden telemetri verilerini alır
Telemetri vericisi	Veri Bilimleri Uluslararası	F50-EEE	3 kanallı telemetri vericisi
Tropikanamid %0.5	Alcon Laboratuvarları		İris genişlemesi
Cımbız (makrocerrahi)	Dünya Hassas Aletler	500092	Karın ve kafa ameliyatı sırasında dokuları manipüle
Cımbız (mikrocerrahi)	Dünya Hassas Aletler	500342	Oküler cerrahi sırasında dokuları manipüle edin

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi edin