Epilepsiye Bağlı Sıçanlarda Epileptik Nöbetlerin Elektroensefalografik Kaydı

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Mikrodiyaliz Prob-elektrot Cihazının Montajı

1. 3 kanallı iki bükümlü bir elektrot kullanın (kayıt elektrodunun en az 20 mm kesim uzunluğu ve 10 cm uzunluğunda bir topraklama elektrotu ile) ve cihazı hazırlamak için bir kılavuz kanüle bağlayın. Şekil 1A-1B'deki diyaliz için 3 kanallı elektrotlar ve kılavuz kanül örneklerine bakınız.
2. Hayvanda mikrodiyaliz probu için geçiş anında çıkarılmasını kolaylaştırmak için metal kılavuz kanülü kullanımdan önce birkaç kez kukla plastik kanüle çıkarın (Şekil 1C) ve yerleştirin (Şekil 1D).
3. Telleri kılavuzun kukla kanülü ile hizalamak için kayıt elektrodunun bükülmüş tellerini iki kez bükün (Şekil 1E-1F) ve elektrot ucunu (Şekil 1G) kılavuz kanülün ucundan 0.5 mm daha uzun olacak şekilde kesin (Şekil 1H) dijital kumpas kullanarak.
4. 1 mm uzunluğundaki silikon çemberi hazırlayın (dış çap [OD] 2 mm, kalınlık 0,3 mm; Şekil 1I) ve kılavuz kanülün ucunu ve bükülmüş elektrotların ucunu cımbız kullanarak silikon çemberin içine yerleştirin (Şekil 1J). Hızlı etkili polimer yapıştırıcı veya reçine ile kılavuz kanül kaidesinin ayağına sabitleyin (Şekil 1K). Şekil 1L ve Şekil 2A'daki tamamlanmış cihazların örneğine bakın.
5. Cihazı mikrop öldürücü ultraviyole (UV) ışık altında 4 saat sterilize edin. Cihazı, her bir tarafı 1 saat boyunca ışığa maruz kalacak şekilde dört kez ters çevirin>< not: Birçok ev yapımı elektrot ve mikrodiyaliz probu benzer şekilde monte edilebilir. Sıçanlar için yukarıda tarif edilen implantın başı aşağıdaki boyutlara sahiptir: 7 mm genişlik x 5 mm derinlik x üstten kaide parmağına kadar 10 mm uzunluk; İmplant ucu yaklaşık 11 mm uzunluğunda, 600 μm çapındadır ve tüm cihaz yaklaşık 330-360 mg ağırlığındadır. (i) Ameliyat sırasında bir sonraki kullanım için kafatası üzerinde yeterli uzunlukta toprak elektrodu bırakılırsa ve (ii) hayvan öldürülürse ve cihaz diş çimentosu ile birlikte geri kazanıldığında, çimentonun mekanik olarak ayrılabilmesi için gece boyunca aseton içinde bırakılırsa, cihaz iki veya üç kez tekrar kullanılabilir, Ve cihaz tekrar yıkandı ve sterilize edildi.

2. Stereotaksik Cerrahi

1. Aseptik ve ağrısız ameliyatlar için çağdaş standartları takip eden cihaz implantasyonu için bir stereotaksik cihaz ve prob klipsi tutucusu (Şekil 2B) kullanın.
   1. Yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarını ketamin / ksilazin karışımı (43 mg / kg ve 7 mg / kg, intraperitoneal [i.p.]) ile uyuşturun ve stereotaksik çerçeveye sabitleyin. Anestezi derinliğini zaman içinde kontrol etmeye izin verdiği için ilk ketamin / ksilazin enjeksiyonuna izofluran anestezisi (havada% 1.4; 1.2 mL / dak) ekleyin. Hayvanın kafasındaki kürkü tıraş edin.
2. Kafa derisi yüzeyini iyot bazlı solüsyon ve ardından aseptik cerrahiye hazırlamak için% 70 etanol ile temizleyin.
   1. Öncelikli olarak (1.1 – 1.5) hazırlanmış kılavuz kanül-elektrot cihazını aşağıdaki koordinatları kullanarak sağ ventral hipokampusa implante edin: burun çubuğu + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm bregmaya. Stereotaksik ameliyatlar için standart teknikleri izleyin.
   2. Ankraj vidalarını kapatmadığından emin olun. Stereotaksik cihaza monte ederken, cihazı kılavuz kanül kafası için kavrayın, çünkü bu, prob tutucuya kolayca hizalanabilir.
3. Cihazı kafatası kemiğine vidalayarak en az dört paslanmaz vidayla kafatasına sabitleyin (sola 1 vida ve sağ ön kemik plakalarına 1 vida, sol parietale 1 vida ve interparietal kemik plakalarına 1 vida). Her vidayı kafatası kemiğine daha fazla sabitlemek için bir damla doku yapıştırıcısı ekleyin.
   1. Vida dişlerinin yarısını metakrilik çimento ile kaplayın. Yapışmayı artırmak için kemikte sığ oluklar açarak çimentonun bağlanmasını teşvik edin.
4. Cihazın ucu beyin dokusuna yerleştirildikten sonra, toprak elektrodunun telini 3 sabitleme vidasının etrafında bükün. Monte edilmiş tüm vidaları ve cihazı diş çimentosu ile kapatın.
5. Hayvanları ameliyat sırasında ve daha sonra yaklaşık 1 saat boyunca dik durana ve kafesin etrafında hareket edene kadar izleyin. Hipotermiyi önlemek için onları bir ısıtma pedi üzerinde tutun. Cihaz implantasyonundan sonra farelerin en az 7 gün iyileşmesine izin verin.
6. Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca hayvanları günde en az bir kez ağrı veya sıkıntı belirtileri açısından izleyin. Enfeksiyonu önlemek için hayvanlara kesilen bölgeye yakın antibiyotikli krem (gentamisin% 0.1) ve ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için 3 gün boyunca analjezik (tramadol 5 mg / kg, i.p.) verin.

3. Pilokarpin ile Temporal Lob Epilepsi İndüksiyonu ve Hayvanların Deney Gruplarına Atanması

1. Ameliyat sonrası iyileşmeden bir hafta sonra, hayvanları rastgele gruplara ayırın: (i) araç alan hayvanları kontrol edin ve (ii) pilokarpin alacak epileptik hayvanlar. Epileptik grup için orantılı olarak daha fazla sayıda hayvan kullanın, çünkü pilokarpin uygulanan sıçanların tümü hastalığı geliştirmeyecektir.
2. Bir doz metilskopolamin (1 mg / kg, deri altından [sc]) enjekte edin ve 30 dakika sonra, status epileptikusu (SE) indüklemek için tek bir pilokarpin enjeksiyonu (350 mg / kg, ip) enjekte edin. Metilskopolamin ve aracı (salin) kontrol farelerine enjekte edin. Tüm i.p. uygulamaları için 25G iğneli 1 mL şırınga kullanın.
   1. Davranışsal nöbetler geçirmeye başlamak için hayvanları görsel olarak kontrol edin (vibrissa'yı 5 dakika içinde hareket ettirmek, başını sallamak, uzuvları klonlamak) ve tüm vücudu sürekli olarak klonlamak için 25 dakika içinde (SE).
3. Başlangıçtan 2 saat sonra SE'yi durdurun, yaklaşık% 25'lik bir mortaliteye ve diazepam (20 mg / kg, ip) uygulamasıyla yaklaşık 10 günlük bir ortalama latent döneme sahip olun. Pilokarpin enjeksiyonundan hemen sonra başlayan herhangi bir nöbet davranışını gözlemleyin ve kaydedin ve bundan sonra en az 6 saat devam edin.
4. Hayvanlara 25G iğneli 1 mL şırınga kullanarak salin (1 mL, ip) ve SE'den sonra 2-3 gün boyunca 1 mL şırınga ve esnek besleme 17G iğne kullanarak sakaroz çözeltisi (1 mL, p.o.) verin.
   1. Pilokarpin SE'den sonraki ilk hafta içinde ilk vücut ağırlığına ulaşamayan hayvanları çalışmadan hariç tutun (vücut ağırlığı takibinin mümkün olmadığı SE'den 24 saat sonra öldürülen akut grup hariç).
5. SE sonrası hayvanları rastgele farklı deney gruplarına atayın (Şekil 3): akut faz (mikrodiyalizin SE'den 24 saat sonra gerçekleştiği), latans (SE'den 7-9 gün sonra), ilk spontan nöbet (SE'den yaklaşık 11 gün sonra) ve kronik dönem (SE'den yaklaşık 22-24 gün sonra başlar, yani ilk nöbetten yaklaşık 10 gün sonra). Hayvanları spontan nöbetlerin oluşumu açısından izleyin.
   not: Epileptik sıçanlarda daha ileri deneyler için aşağıdaki dahil etme / dışlama kriterlerini kullanın: pilokarpin uygulamasından sonraki 1 saat içinde konvülsif SE gelişimi; SE'den sonraki ilk hafta kilo alımı ve mikrodiyaliz probu ile elektrotun doğru konumlandırılması.

>4. Epileptik Davranış İzleme ve Analizi

1. Epileptik davranışın uzun süreli izlenmesi
   1. Pilokarpin uygulamasından yaklaşık 6 saat sonra (yani, araştırmacılar tarafından doğrudan gözlem sonunda), hayvanları temiz ev kafeslerine yerleştirin ve 24 saatlik video izlemeye başlayın.
   2. Dijital video gözetim sistemi kullanarak 5. güne kadar 24 saat video izlemeye devam edin.
   3. 5. günden itibaren, fareleri evlerindeki dikdörtgen kafeslerde bağlı EEG kayıt sistemine bağlayın ve 24 saat video izlemeye devam edin.
   4. Faraday kafesinin dışına yerleştirilmiş amplifikatördeki parametreleri ayarlayın (her bir hayvanın EEG sinyalinin özgüllüğüne göre her kanalda amplifikasyon faktörünü ayarlayın) ve bağlı olmayan kablolar tarafından üretilen EEG sinyalini gözlemleyerek EEG alımını başlatın. 200 Hz'lik bir örnekleme hızı ve 0,5 Hz'e ayarlanmış alçak geçiren filtre kullanın.
   5. Hayvanı kablolara bağlayın, bir elinizin iki gerilmiş parmağı arasında bir hayvanın kafasını tutun ve diğer serbest elinizi kullanarak konektörleri elektrot kaidesine vidalayın. Satın alma işlemini başlatın.
      Dikkat: Sinyalde yapaylık olmadığından emin olun. Yaygın eserler, ölçeği büyük ölçüde aşan sivri uçlardır.
   6. Mikrodiyaliz deneyinden bir gün önce, hayvanları mikrodiyaliz için pleksiglas silindirlerle donatılmış bağlı EEG sistemine aktarın. Hayvanları ev kafesindeki EEG bağlama sisteminden ayırın ve hayvanı dizginlemeden elektrottan konektörleri vidalayın. Hayvanı yüksek pleksiglas silindirlere yerleştirin.

Şekil 1. İmplante edilecek cihazın adım adım hazırlanması. (A) Cihazı monte etmek için gerekli olan soldaki koruyucu kılıfında 10 cm uzunluğunda topraklama elektrotu ve sağda mikrodiyaliz için kılavuz kanül bulunan 3 kanallı elektrot. (B). Çıplak elektrot ve kılavuz kanül ayrıntılı olarak. İlk adım, hayvanın kafasına implante edildikten sonra serbest bırakılmasını kolaylaştırmak için metal kılavuz kanülü plastik mankeninden birkaç kez çıkarmak (C) ve sokmaktır (D). İkinci adım, diyaliz kılavuz kanülüne (E, F) hizalanacak şekilde bükülmüş kayıt elektrodunu iki kez bükmektir. (G) Elektrot ucu, metal kılavuz kanülün ucundan 0,5 mm daha uzun olacak şekilde kesilmelidir. (H) Dijital kumpas kullanarak kesimin hassasiyetini kontrol edin. Daha sonra, kanül ayağını (I) yönlendirmek için elektrotun hizalamasını sabitlemek için yaklaşık 1 mm uzunluğunda silikon çember kullanılmalıdır. (J) Elektrotun ve kılavuz kanül milinin nasıl çalınacağını gösteren fotoğraf. Son adım, silikon çemberi ona (K) sabitleyen kılavuz kanül kaidesine bir damla reçine veya yapıştırıcı koymaktır. (L) Sterilize edilmeye hazır monte edilmiş cihaz.

Şekil 2. Kullanılan sıçanlarda mikrodiyaliz-EEG için farklı tipteki cihazların fotoğrafları (A) ve bu cihazları implante etmek için kullanılan prob klipsi tutucusunun (B) fotoğrafı. (A) Kılavuz kanül (yeşil renkte), deneyden tipik olarak 24 saat önce bir mikrodiyaliz kanülü ile değiştirilir. Cihazın elektrik konektörü (bu el yazmasında açıklanan kayıtlar için ilk solda kullanılmıştır), elektrik sinyalini ileten tellerin amplifikatöre ve veri toplama ekipmanına bağlanmasına izin verir. Cihaz, anestezi uygulanmış sıçanların kafatasına cerrahi olarak takılır ve serbest davranan sıçanlarda ağrı veya rahatsızlığa neden olmadan daha sonra kayıtlar elde edilebilir.

Şekil 3. Deney tasarımı. Durum epileptikus (SE) indüksiyonundan bir hafta önce, sıçanlar cihazla implante edilir. SE, pilokarpin tarafından indüklenir ve hayvanlar (diyalize alınmaz ve SE'den 24 saat sonra öldürülmezse; akut gruptaki sıçanlar) 5 gün boyunca video ile izlenir (mavi çizgi), daha sonra ev kafeslerinde nöbet sıklığını ve süresini değerlendirmek için video-EEG izlenir (yeşil çizgi). Mikrodiyaliz deneyi için, epileptik ve ilgili epileptik olmayan kontrol fareleri, mikrodiyaliz seansından 24 saat önce silindir kafeslerle donatılmış başka bir EEG düzeneğine aktarılır ve hala video-EEG izlenir (açık yeşil çizgi). Dikey kırmızı çizgiler, epileptik hastalık gelişiminin farklı zaman noktalarındaki diyaliz seanslarını temsil eder. Yatay kırmızı çizgiler, okun mikrodiyalizin son gününü ve hayvanın ölüm gününü gösterdiği farklı epileptik hayvan gruplarını (ve ilgili epileptik olmayan hayvanları) temsil eder.