$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Bir Dalgıç Dilim Odasında Sinaptik Tepkilerin Kaydedilmesi
>NOT: Malzeme Tablosuna bakın.
- aCSF çözeltisini bir su banyosunda yaklaşık 28-30 °C'ye önceden ısıtın (bu, kayıt odasında kabarcık oluşumunu önleyecektir).
- Geri dönüşüm sistemini başlatın (4-5 mL/dak) ve sistemi en az 1 saat dengelemek için hat içi ısıtıcıyı etkinleştirin.
- Küçük bir lens temizleme kağıdı parçasını ve U şeklinde bir platin tel üzerine sabitlenmiş naylon bir ağı daldırma dilimi haznesinde birkaç dakika önceden ıslatın (Şekil 1).
- U şeklindeki platin teli çıkarın.
- Geri dönüşümü kapatın ve lens temizleme kağıdına bir dilim yerleştirin.
- Dilim tutma ağını hemen dilimin üzerine yerleştirin, pompayı açın ve objektifi aCSF'ye daldırmadan dilimin 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
- Borosilikat mikropipeti (yani kayıt elektrodu) aCSF ile doldurun (uç direnci: 1-2 MΩ, 1/3 oranında aCSF ile doldurulmuş) ve pipet tutucusuna monte edin.
- Test edilmiş epoksi yalıtımlı tungsten stimülasyon elektrodunu manipülatör tutucusuna ve referans tellerini dilim haznesine yerleştirin.
- Hazneye ikinci bir referans elektrodu ekleyin ve bunu kayıt elektrodunun baş kısmının referans soketine bağlayın (Şekil 1A).
- Amplifikatör kontrol yazılımında "zero clamp mode" kutucuğuna tıklayınız ve "output gain list" kutucuğuna çift tıklayarak ilerleyiniz. "100" kazancını seçin, "yüksek geçiren filtre liste kutusunu (Bessel) çift tıklayın", "0.1 Hz"i seçin ve "3 kHz"i seçmek için "düşük geçiren filtre liste kutusunu (AC)" çift tıklayın.
- Kayıt yazılımında, "Kazan | Açık Protokol." Epizodik stimülasyonlara ve güçlendirilmiş potansiyellerin 10-20 kHz'de 50-100 ms boyunca dijitalleştirilmesine izin veren ayarlara sahip ve epizodik bir kaydın başlamasından 10 ms sonra otomatik olarak bir uyaran izolatörünü tetikleyen bir protokol seçin.
- Stimülasyon ve kayıt elektrotlarını stratum pyramidale ile aynı hizada ve paralel olarak yerleştirin, örneğin (Şekil 1B ve Şekil 2).
- "Kazan | Protokolü Düzenle" ve "tetikleyici" sekmesini seçin (açılır pencerede). "Tetikleyici kaynağı" kutusuna tıklayın ve tetikleyici kaynağı olarak "boşluk çubuğu"nu seçin. "Tamam" düğmesini tıklayın. Alımı başlatmak için "kaydet" düğmesine tıklayın ve bir tetik düğmesi olan açılır pencereye dikkat edin.
- Uyaran izolatör yazılımında, "voltaj kontrolü" kutusuna tıklayın ve "0" girin. "İndir" düğmesini tıklayın. "Kayıt yazılımı" penceresine tıklayın ve boşluk çubuğuna basın. 1'den 8'e kadar olan değerleri sırayla girerek bu döngüyü tekrarlayın, örneğinample, "voltaj kontrolü" kutusuna 1 mV'luk adımlarla.
- Stimülasyon kuvvetini fEPSP eğim değerleri ile ilişkilendirin ve fEPSP eğimi maksimumunun %40'ını elde etmek için gereken stimülasyon kuvvetini belirleyin. "Voltaj kontrol kutusuna" tıklayın ve belirlenen değeri girin. "İndir" düğmesini tıklayın.
not: Beyin dokusuna kısa voltaj veya akım darbeleri uygulamak için bir uyaran izolatörü kullanılır. Bifazik darbeler faz başına 100 μs'ye sahip olabilir.
- Kayıt yazılımında, durdur düğmesine ve ardından "Al" menüsüne tıklayın. "Protokolü Düzenle"ye tıklayın ve açılan pencerede "tetikleyici" sekmesini seçin. Tetikleyici kaynak kutusuna tıklayın ve tetikleme kaynağı olarak "dahili zamanlayıcıyı" seçin. "Tamam" düğmesini tıklayın. Örneğin, her 30 saniyede bir alan potansiyellerinin otomatik kaydını başlatan kayıt düğmesine tıklayın. 30-60 dakika sonra "durdur" düğmesine tıklayın.
- "Al" menüsüne tıklayın, "Protokolü Aç"a tıklayın, sinaptik plastisitenin istenen indüksiyon protokolünü seçin ve "Tamam" düğmesine tıklayın. Yüksek frekanslı stimülasyonu ve kaydı otomatik olarak etkinleştirmek için "kaydet" düğmesine tıklayın. "Durdur" düğmesine tıklayın.
not: Sinaptik plastisite ile ilgili çalışmalar söz konusu olduğunda, uzun süreli başlangıç kaydından sonra uzun süreli güçlendirme veya uzun süreli depresyon için standart indüksiyon paradigmalarından birini uygulayın. Sinaptik iletimin ortaya çıkan modülasyonunun temsili örnekleri Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterilmiştir.
- Kayıt yazılımında, "Al | Protokolü Aç" seçeneğini seçin ve adım 4.12'deki protokolün aynısını seçin. "Tamam" düğmesini tıklayın ve ardından "kaydet" i tıklayın. Örneğin, alan potansiyel kayıtlarını 2-4 saat boyunca otomatik olarak çalıştırmaya devam edin. Kaydı sonlandırmak için "durdur" düğmesine tıklayın.
- Farmasötik çalışmalar söz konusu olduğunda, kalıcı bileşik uygulaması isteniyorsa, bileşiği doğrudan aCSF rezervuarına uygulayın (Şekil 3).
