Yenidoğan Bir Kemirgenden Beyin Sapı-Omurilik Preparatlarının Elektrofizyolojik Kayıtları

Özet

Kaynak: Rousseau, J., et al. Yenidoğan Kemirgenlerinden İzole Beyin Sapı-Omurilik Preparatları Üzerindeki Elektrofizyoloji, Nöral Solunum Ağı Çıkış Kaydına İzin Veriyor. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, yenidoğan kemirgenlerinden izole edilmiş beyin sapı-omurilik preparatlarının elektrofizyolojik kayıtlarını göstermektedir. Preparat bir kayıt odasına yerleştirilir ve beyin sapından gelen inspiratuar patlamalar, omurilikteki dördüncü ventral sinir kökü kullanılarak oksijenli ve oksijensiz koşullar altında kaydedilir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Kurulum ve Hazırlık

1. Çözümleri
   1. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) stok çözeltilerini aşağıdaki tariflere göre hazırlayın. Literatürde konsantrasyon varyasyonları olan başka tarifler de mevcuttur. Stok çözeltilerini bir aya kadar 4 °C'de saklayın.
      1. Tuz çözeltisi: 75.39 g NaCl (129 mM final); 2.5 g KCl (3.35 mM final); 0.81 g NaH₂PO4 (0.58 mM final); 2.33 g MgCl₂ (1.15 mM final); 1.85 g CaCl₂ (1.26 mM). 800 ml damıtılmış suda eritin, ardından damıtılmış su ile 1 L'ye kadar doldurun.
      2. Bikarbonat çözeltisi: 17.65 g NaHCO₃ (21 mM final) ekleyin. 900 ml damıtılmış suda eritin, ardından damıtılmış su ile 1 L'ye kadar doldurun. Bikarbonat konsantrasyonundaki değişiklikler pH değişimlerine neden olacaktır.
      3. Glikoz çözeltisi: 54.06 g glikoz ekleyin (30 mM final). 400 ml damıtılmış suda eritin, ardından 500 ml'ye kadar damıtılmış su ile doldurun.
   2. 100 ml tuz çözeltisi, 100 ml bikarbonat çözeltisi ve 50 ml glikoz çözeltisini 1 L damıtılmış su içinde seyrelterek aCSF'yi hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
   3. Bir cam tüpü kırılana kadar ısıtarak ve gererek bir cam elektrot hazırlayın. Kullanmadan önce ucu zımparalayın. Elektrot temiz kaldığı sürece birçok kez tekrar kullanılabilir.
2. Deney Düzeneği
   not: Kurulum ayrıntıları Şekil 1'de sunulmuştur.
   1. Amplifikatörü, hareketli ortalamayı, veri toplama sistemini, sıcaklık kontrol cihazını ve pompayı açın. Sinyal amplifikasyonunu (kazanç = 10.000), filtrelemeyi (düşük eşik, 10 Hz; yüksek eşik, 5 kHz) ve ham sinyalin analogdan dijitale dönüşümünün örnekleme hızını (2,5 kHz) kontrol edin.
   2. Bir şişeyi aCSF ile doldurun ve karbojen (% 95 O₂,% 5 CO₂) ile köpürtün. Kayıt odasında (hacim 5 ml) 4 ml / dk'da kabarcıklı ve ısıtılmış bir aCSF akışı indükleyin. Kayıt odasındaki sıcaklığı 26 (± 1) °C'de tutun. Bu standart koşullarda pH 7,4 olmalıdır.
   3. Diseksiyon odasının yakınında 50 ml'lik bir şırıngada 50 ml oda sıcaklığında (RT) ve karbojen kabarcıklı aCSF'yi saklayın.
   4. Bilgisayarı açın ve kayıt yazılımını başlatın.

2. Diseksiyon

1. Hayvanın cinsiyetini tartın ve görsel olarak belirleyin (erkeklerin ano-genital mesafesi daha uzundur, dişilerin ise kısa bir ano-genital mesafesi vardır; erkek cinsel organları genellikle karanlık, dişi cinsel organları pembedir).
2. Yenidoğan kemirgenleri aşağıdaki seçeneklerden biriyle uyuşturun: kriyoanestezi (hayvanı 4-5 dakika boyunca tamamen buza daldırın), enjeksiyon (4 ml / kg'da equitensine) veya uçucu anesteziklerin solunması (izofluran veya eter). Pençe çekme refleksinin yokluğunda yeterli bir anestezi düzlemini onaylayın.
3. Hayvanı ventral yüzü aşağı bakacak şekilde bankın üzerine yerleştirin. Başın rostral kısmını, bregma seviyesinde bir neşter ile koronal olarak bölümlere ayırın (deri ve kafatasından görülebilir). Bu adımı, hayvan uyuşturulduktan hemen sonra gerçekleştirin.
4. Vücudu ön elemanların altında bir neşter ile koronal olarak bölümlere ayırın.
5. Cildi, kasları, yağ dokularını ve iç organları cerrahi ve ince makas ve pense ile çıkarın. Bu yaşta kemikler yumuşak olduğu için sinir sistemine zarar vermemek için dikkatli olun. Bu adımı tezgah üzerinde gerçekleştirin.
6. Preparasyonu diseksiyon odasına yerleştirin. Preparatı oksijenlendirmek için şırıngada saklanan aCSF'yi kullanın. Bu noktadan kaydın sonuna kadar bir mikroskop kullanın.
7. Preparatın dorsal yüzünde, kafatasını ve omurları cerrahi ve ince makas ve pense ile orta eksen boyunca rostraldan kaudal kısma doğru kesin. Sinir dokusunu ortaya çıkarmak için kesilen kafatasını ve omurları açın. Preparatı oksijenlendirmek için şırıngada saklanan aCSF'yi kullanın.
8. Pense ile sinir dokusunun yüzeyini kaplayan ince bir doku olan araknoid zarı çıkarın. Pia mater ve kan damarlarını sinir dokusuna karşı tutun. Preparatı oksijenlendirmek için şırıngada saklanan aCSF'yi kullanın.
9. Preparasyonu sırt kısmı aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve preparatı yerinde tutarken sinirleri ve bağ dokusunu makasla keserek beyin sapını ve omuriliği dikkatlice aşağı indirin. Dorsal bir yaklaşım da mümkündür. Kökleri ve sinirleri mümkün olduğunca uzun süre tutun. Beyin sapını ve omuriliği izole etmek için kemikleri çıkarın. Preparatı oksijenlendirmek için şırıngada saklanan aCSF'yi kullanın.
10. Beyincik ve kalan rostral yapıları neşter ile bölümlere ayırarak çıkarın. Preparatı oksijenlendirmek için iğnede saklanan aCSF'yi kullanın.
11. İsteğe bağlı olarak, deneysel tasarıma bağlı olarak, inferior serebellar arterin önündeki bir koronal bölüm ile neşter ile ponsu çıkarın. Tüm ponsları tutmanın sıçanlarda ritmi yavaşlatacağını ve farelerde tamamen inhibe edeceğini unutmayın. Ponsun sadece kaudal kısmını içeren preparatlar, C4 kökünde stabil bir frekansa sahip solunum benzeri bir aktivite gösterir.

>3. Kayıt

1. Preparatı ventral yüzü yukarı bakacak şekilde kayıt odasına yerleştirin. Preparayı, omuriliğin en alt kısmındaki ve beyin sapının en rostral kısmındaki pimlerle sabitleyin.
2. Elektroda iğne ile bağlı bir şırınga kullanarak, elektrodu kısmen aCSF ile doldurmak için şırınga pistonunu dışarı çekerek elektrotta bir çöküntü (cam uç çapı: 150 - 225 μm) indükleyin.
3. Bir mikromanipülatör kullanarak, elektrodu dikkatlice dördüncü ventral köklerden birine yakın bir yere yerleştirin. Diğer ventral kökler de solunum benzeri bir aktivite gösterebilir (ör., XII kraniyal sinir, C1 ventral kök).
4. Sinir kökünü nazikçe aspire etmek için pistonu dışarı çekerek şırınga yoluyla elektrot tankında bir çöküntüye neden olun. Daha sonra elektrodu omuriliğe uygulamak için dikkatlice hareket ettirin.
   not: İdeal olarak, kökün boyutu elektrot açıklığının boyutuyla eşleşir ve böylece elektrotun iç ve dış bölmeleri arasında bir sızdırmazlık oluşturur. Diferansiyel amplifikatörler bu tür kayıtlar için yaygın olarak kullanıldığından, elektrotun içi ile kayıt odası arasındaki herhangi bir açıklık sinyalin kalitesini düşürür ve arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmayı zorlaştırır.
5. Kaydı başlatın.
6. Preparatın temel parametrelerini belirlemek için normoksik koşullar altında (yani, karbojen ile köpürtülmüş aCSF:% 95_O2 ve% 5 CO₂) en az 20 dakika boyunca preparat tarafından üretilen ritmi kaydedin.
7. Perfüzyonu 15 dakika boyunca karbojen kabarcıklı aCSF'den uyaran aCSF'ye (yani, hipoksi uyaranı için% 95 N₂ ve% 5 CO₂ ile kabarcıklı) geçirin. Deneysel protokole bağlı olarak maruz kalma süresini değiştirin. Maruz kalma süresini kayıt ve hayvan veri sayfasına kaydedin. Tüpün dışına gaz difüzyonunu önlemek için mümkün olduğunda aCSF şişesi ile hazne arasında paslanmaz çelik borular kullanın.
8. Kurtarma kaydı için perfüzyonu en az 15 dakika boyunca standart karbojen kabarcıklı aCSF'ye geri getirin. Bunu kayıt ve hayvan veri sayfasına kaydedin.
9. Kaydı sonlandırın.

Sonuçlar

Şekil 1. Kurulumun özetleyici şeması.Kabarcıklı aCSF, kayıt odasındaki bir pompa tarafından ısıtılır ve gönderilir. Kayıt odasındaki aCSF fazlası bir pompa ile aspire edilir ve atılır. Kayıt odası toprağa ve sıcaklık kontrol cihazına bağlıdır. Elektrot çıkışı doğrudan amplifikatöre, ardından hareketli ortalamaya ve veri toplama sistemine ve son olarak bilgisayara iletilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sylgard Belediyesi	Sigma Aldrich	761036-5EA	Kaputun altında kullanın
NaCl (Doğal)	Biyodükkan	SOD002
Kartal	Biyodükkan	POC888
CaCl2	Biyodükkan	CCL444
MgCl2	Biyodükkan	MAG510
NaHCO3	Biyodükkan	SOB999
NaH2PO4	Biyodükkan	SPM306
D-glikoz	Biyodükkan	GLU501 Serisi
Karbojen	Linde (Ihlamur	343-02-0006
Sıcaklık kontrolörü	Warner Instruments, Hamden, CT, ABD	TC-324B
Emme elektrodu	A-M Sistemleri, Everett, WA, ABD	Ürün Kodu: 573000
Diferansiyel AC amplifikatör	A-M Sistemleri, Everett, WA, ABD	Tip 1700
Hareketli ortalama	CWE, Ardmore, Pensilvanya, Amerika Birleşik Devletleri	model MA-821
Veri toplama sistemi	Dataq Aletleri, Akron, OH, Amerika Birleşik Devletleri	model DI-720
LabChart yazılımı	Uygulamalar, Colorado Springs, CO, Amerika Birleşik Devletleri
Prizma yazılımı	Graphpad, La Jolla, CA, Amerika Birleşik Devletleri
Kayıt odası	Ev yapımı
taban	Kanetec, Bensenville, IL, Amerika Birleşik Devletleri
Mikromanipülatör	Dünya Hassas Alet A.Ş., Sarasota, FL, ABD	MB
taban	Kanetec, Bensenville, IL, Amerika Birleşik Devletleri	UÇURTMA-R
Peristaltik pompa	Gilson, Middleton, WI, Amerika Birleşik Devletleri	MB
Faraday Kafesi	Ev yapımı	MINIPULS 3
bilgisayar

· Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi T