Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Cerrahi Hazırlık
- Güvenli ve steril bir ameliyat sağlamak için vericiyi temizleyin ve hazırlayın. Vericiyi antistatik ambalajından çıkarın ve %70 etanol püskürtün veya ıslatın. Vericiyi steril tuzlu su ile durulayın ve steril tuzlu suya batırılmış steril pamuklu süngerlerin arasına yerleştirin veya steril tuzlu suya batırılmış halde tutun.
- Ameliyat için gerekli aletleri toplayın ve sterilize edin, sterilizasyon için otoklav buharlayın. Cerrahi aletlerin listesi için malzeme ve reaktifler tablosuna bakın.
2. Cerrahi İmplantasyon
- Hayvanları uyuşturun ve IACUC onaylı protokole göre anesteziyi koruyun. Başlangıçta ve ameliyat sırasında her 15 dakikada bir ayak parmağını kıstırma refleksini kontrol edin. Yanıt eksikliği yeterli anestezi seviyesini gösterir.
- Yavrular için, O2 (% 100) ile izofluran (% 4) ile anestezi kullanın. Yetişkinler için, ksilazin (10 mg / kg) ile ketamin (100 mg / kg) kullanın.
- Stereotaksik çerçevedeki konumu sabitleyin. Kulak çubuğu uçlarını işitsel meatusa yerleştirin. Genç sıçan yavrularında kafatası çok yumuşak olduğu için kulak çubuklarını aşırı sıkmayın. Anestezi burun konisini sabitleyin.
- Hayvanı 37 °C'ye ayarlanmış ısıtma yastığının üzerine yerleştirerek ameliyat sırasında sıcak tutun. Yetişkin hayvanlarda, hayvanın gözlerine kayganlaştırıcı merhem sürün.
- Kesi bölgesini sterilize edin ve steril cerrahi alanı koruyun.
- Saç derisini alternatif %70 etanol ve betadin uygulamalarıyla temizleyin. Kafa derisinin ortasından başlayın ve giderek daha geniş eşmerkezli daireler çizin.
- Hayvanı örtü ile örtün ve ameliyatı örtülü hayvan üzerinde yapın. Cerrahi kurulumu steril örtüler, %70 etanol içeren püskürtme ekipmanı ile kaplayarak steril cerrahi alanı koruyun.
- Steril cerrahi eldiven ve önlük giyin (veya kurumun gerektirdiği şekilde). Steril bir alanın korunmasına yardımcı olmak için bir cerrahi asistan kullanın.
- Hayvanın kafa derisinde, orta hat boyunca gözlerin biraz arkasında, yaklaşık 2 cm'lik bir kesi yapın. Genç sıçan yavrularında kafatası hala çok yumuşak olduğu için neşteri yerleştirirken dikkatli olun. Kesiğin daha az kanaması ve daha hızlı iyileşmesi için tek bir kesim yapın.
- Kafatasını açığa çıkarın. Verici ile kafatasının kemikleri arasındaki bağı en üst düzeye çıkarmak için temiz ve kuru bir alan hazırlayın. Kafa derisini kavramak için anevrizma klipsleri kullanın.
- Saç derisini dört köşeden nazikçe orta çizgiden uzaklaştırın. Kafatasında bregma ve lambda gibi anatomik yer işaretlerini arayın. Kafatası kemiklerinin bu yaştaki hayvanlarda kaynaşmadığını unutmayın. Çapak deliği için doğru yeri bulmak için Paxinos'un stereotaksik koordinatlar atlasını kullanın.
- Çapak tipi matkap ucuna sahip Dremel tipi bir alet kullanın. Deliklerin çapı 300 μm'den büyük olacak şekilde istenen kayıt konumlarında iki çapak deliği oluşturun. Referans elektrot için çapak deliğini, kafatasının lambdasının arkasındaki beyinciğin üzerine yerleştirin.
- Verici üzerindeki tellerin çapak delikleriyle hizalandığından emin olun. Elektrot telleri hizalanmazsa, elektrotların tutkalla kirlenmesi muhtemeldir ve sinyalin zayıf olmasına neden olur. Kabloları hizalamak için vericinin oturup oturmadığını kontrol edin ve elektrotları çapak delikleri için amaçlanan yerler üzerinde hizalanacak şekilde hafifçe bükün.
- Elektrot uçlarını kesin. Elektrotları istenen uzunlukta kesmek için cerrahi makas kullanın. Elektrot derinliği, deney için gerekli olan kayıt türü için önemlidir (yani, EEG kayıtları için elektrotları dura'nın üzerine yerleştirin veya tanımlanmış beyin yapıları için stereotaksik koordinatları kullanın).
- Elektrotların kaplanmasını önlemek için alanı kaplamak için vericinin tabanına bolca siyanoakrilat uygulayın. Siyanoakrilat yapıştırıcı bir elektrik yalıtkanıdır, elektrotları yapıştırıcı ile kirletmek sinyale neden olmaz.
- Derin beyin yapılarından kayıt yapıyorsanız, vericiyi kanül tutucuya monte edin ve z ekseni kontrolü için stereotaksik kola yerleştirin. Stereotaksik kolu kullanarak vericiyi uygun derinliğe indirin ve vericinin etrafına siyanoakrilat jel yerleştirin.
- Güçlü yapışkan bağ sağlamak için vericiyi yerleştirmeden önce kafatasını iyice kurulayın. Siyanoakrilat ile kaplanmış vericiyi kafatasına uygulayın. Elektrotları karşılık gelen çapak delikleriyle hizalamaya dikkat edin.
- Büyük vasküler yapılara zarar vermekten kaçınmaya çalışın. Vericiyi bir dakika boyunca hafif bir basınçla yerinde tutun. Verici ile kafatası arasında güçlü bir bağ oluşturmak için hafif bir baskı uygulayın.
- Verici / kafatası arayüzünü tamamen kapatmaya yetecek kadar ek siyanoakrilat uygulayın. İyi bir uyum ve güçlü bir bağ sağlamak için, yapıştırıcının kafatasına temas eden yüzey alanını en üst düzeye çıkarın. Siyanoakrilat yapıştırıcıyı vericinin etrafına bir daire şeklinde uygulayın ve vericinin hem kafatasının hem de duvarının kaplandığından emin olun.
- İmplante edilen vericinin tabanındaki siyanoakrilatın etrafına bir şırınga aracılığıyla kimyasal hızlandırıcı (0.1 ml) uygulayın. Komşu dokuya uygulamamaya dikkat ederek ivmeyi idareli kullanın.
not: Siyanoakrilat kürlemenin kimyasal olarak hızlanması, verici ile kafatası arasındaki güçlü bağın hızlı bir şekilde oluşmasını sağlar. Siyanoakrilat hızlandırıcı, yapıştırıcının kürlenmesini hızlandırmak için yararlıdır ancak gerekli değildir.
- Alanı steril tuzlu su ile iyice yıkayarak hızlandırıcıyı çıkarın. Siyanoakrilat hızlandırıcı, insizyon bölgesinden yıkanmazsa doku tahrişine neden olabilir. Alanı yıkamak için 1.0 ml'lik bir şırıngayı steril tuzlu su ile doldurun ve alanı bir şırınga iğnesi ile sulayın. Genel olarak, hızlandırıcıyı yıkamak için 0,5 ml salin yeterlidir.
- Vericinin tabanının etrafındaki cildi dikin, ancak vericiyi kapatmayın. Nöral sinyalleri verimli bir şekilde iletmek için vericinin üst kısmı cildin üzerinde olmalıdır. Cilt, vericinin ve ünitenin etrafındaki yapıştırıcının çevresinde makul ölçüde sıkı olmalıdır. Vicryl veya ipek sütür (yumuşak iplik) kullanın; Olgunlaşmamış hayvanlarda deri yumuşaktır ve yumuşak dikişler kullanılmazsa kolayca zarar görür. Yetişkin hayvanlar için herhangi bir dikiş malzemesi kullanın.
- Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kurtarma için ısıtılmış battaniyenin üzerine yerleştirin.
- Baraja dönmeden önce hayvanların sıcak (37 °C) ve ayakta (yani tamamen iyileşmiş) olduğundan emin olun. Hayvanın sırtındaki cildi sıkıştırarak hayvanın sulandırıldığından emin olun (hayvan susuz kalırsa, deri deforme olur). Hayvan susuz kalırsa, laktasyonlu Ringer tamponunun deri altı enjeksiyonunu uygulayın. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
- Cerrahi sonrası ağrı yönetimi için hayvanlara buprenorfin (0.05 mg / kg) uygulayın ve enjeksiyon bölgesi çevresinde deri altı 0.1 ml bupivakain enjeksiyonu yapın.
not: Bu yaştaki hayvanlar için baştan sona tüm prosedür 5-10 dakika içinde tamamlanmalıdır (doğum sonrası 6. gün). Yaşlı hayvanlar için ameliyat süresi daha uzun sürebilir.
3. Bakım ve Barınma
Not: Bazı barajlar, cihazla implante edilen yavruları tolere etmeyebilir. Toleranslı olan barajların seçilmesi gerekebilir. Barajın, yavruları verici tarafından alarak kafesin etrafında hareket ettirmesi kabul edilebilir.
- Hayvanlar sütten kesildikten sonra, cihazların kafes arkadaşlarından çıkarılmasını önlemek için onları tek tek barındırın.
- Sıkıntı belirtileri olduğunda hayvanları öldürücü dozda pentobarbital (25 mg / kg) veya izofluran (bir çan kavanozunda) ile ötenazi yapın.
- Not: Tel ekleri olan bazı hayvan barınağı kafesleri, implante edilmiş vericilerle etkileşime girebilir. Hayvanların, vericiyi tel ekinin 'çubukları' arasına sıkıştıramayacağından emin olmak için tel ekinin yüksekliğini kontrol ettiğinizden emin olun.
4. EEG kaydetme
- Hayvanı kendi başına bir kafese yerleştirin veya littermates ve barajla birlikte barındırın. Bununla birlikte, implante edilmiş bir hayvanı tek bir kafese yerleştirin. Yavruları kayıt odasında 2 saatten fazla yalnız bırakmayın. Hayvanları sıkıntı ve dehidrasyon belirtileri açısından izleyin.
- Sağlanan güç kaynağını alıcı tabanına bağlayın ve güç ışığının yandığını doğrulayın. Bayonet Neil-Concelman (BNC) kablolarını kullanarak alıcı tabanını bir veri toplama sistemine bağlayın.
- Hayvan kafesini alıcı tabanının üzerine yerleştirin (Şekil 1). "Sinyal" ışığı yanmalıdır, bu da bir vericinin algılandığını gösterir. Veriler artık kaydedilebilir.
- Verileri kaydetmek için alıcı tabanını analogdan dijitale dönüştürücüye bağlayın ve dönüştürücüyü bir bilgisayara bağlayın (Şekil 2).
- Kaydın örnekleme hızını ayarlayın. Verilerin doğru şekilde örneklendiğinden emin olun. En az 250 Hz örnekleme hızı seçin (500 Hz önerilir) kayıt için (vericinin bant genişliği 0.1-100 Hz'dir).
- Sayısallaştırılmış verileri kaydedin ve Matlab gibi sinyal işleme yazılım paketlerini kullanarak analiz edin.
