$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Beyin Dilimlerini Kesmek için Kurulum
- (mM) 125 Kolin-Cl, 2.5 KCl, 0.4 CaCl2, 6 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, karbojen gazı ile doymuş 20 D-glikoz (% 95 O2-5% CO2) ve (mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2'den oluşan yapay bir beyin omurilik sıvısı (aCSF) kayıt çözeltisinden oluşan bir kesme çözeltisi hazırlayın, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glikoz, karbojen ile doymuş. Soğuk tutmak için kesme solüsyonunu buzun üzerine yerleştirin.
- Yaklaşık 400 ml kesme solüsyonunu dondurun ve bir buz bulamacı oluşturmak için 100 ml donmamış kesme solüsyonu ile karıştırın. Sabit ama yumuşak bir kabarcık akışı elde etmek için küçük kalibreli boru veya sinterlenmiş camdan yaklaşık 0,5 L / dk'lık bir akışta karbojen (% 95 O2-% CO2) ile kabarcık oluşturun.
- Beyin dilimlerinin yerleştirileceği yükseltilmiş bir naylon ağ eki olan 250 ml'lik bir beher hazırlayın. Ağı yaklaşık 2 cm kaplayacak şekilde aCSF ile doldurun ve kabarcıkların dilim tutma alanını doğrudan bozmamasını sağlamak için karbojen ile köpürtün. Naylon ağda hava kabarcığı olmaması da önemlidir, bu nedenle varsa bunları çıkarın. Bu tutma odası olacaktır ve RT'de (20 - 25 °C) tutulur.
- Büyük bir makas, küçük bir makas, küçük ve büyük mikro spatulalar ve büyük ve küçük forseps çiftleri dahil olmak üzere diseksiyon aletlerini yerleştirin ve buz üzerinde soğutun. Vibratom doku kesme bloğunu bir kare alüminyum folyo üzerine buz üzerine yerleştirin. 2 adet 6 cm'lik filtre kağıdı, tek kenarlı bir tıraş bıçağı ve kesme solüsyonu bulamacı ile doldurulmuş 25 ml'lik bir beher elde edin.
- İkinci bir kabı buzla doldurun ve buzun üzerine bir parça kağıt mendil koyun ve üstüne 12 cm'lik bir kültür kabı yerleştirin. Kültür kabını kesme çözeltisi, buz, bulamaç ve karbojen ile kabarcık ile doldurun. Bu, beyin diseksiyonunun yapılacağı kaptır.
- Vibratomu hazırlayın. Yeni, iki ucu keskin bir tıraş bıçağını (her seferinde yeni bir bıçak kullanın) ambalajından çıkarın ve %80 etanol ve ardından deiyonize su püskürtün. 3 ml'lik plastik transfer pipetini incelmeye başladığı noktadan kesin. Bu, beyin dilimlerini aktarmak için kullanılacaktır. Tabanda 27 G'lik bir iğneyi yaklaşık 45° bükün ve 1 ml'lik bir şırıngaya takın. Bu, kesme sırasında dilimleri manipüle etmek için kullanılacaktır.
2. Beyin Dilimlerini Kesme
- Bir fareyi (P16-P18)% 2 izofluran veya lokal olarak onaylanmış bir yöntemle uyuşturun. İndüksiyonu takiben, hayvanın başını büyük bir makasla ayırın ve kafayı kabarcıklı kesme çözeltisi bulamacı içeren 12 cm'lik kültür kabına bırakın. Bulamaç, hızlı soğutma için kafayı tamamen daldırmalıdır.
- Bir elinizle başın ön tarafını tutun, cildi ve bağ dokusunu soyun, buruna doğru ilerletin. Küçük makası kullanarak, alttaki kafatasını ortaya çıkarmak için bağ dokusunu kesin. Daha sonra kafatasının ve boynun dorsal yönünü kaplayan kasları çıkarın.
- Önce kafatasının önünü büyük forseps ile sabitleyerek beyni kafatasından çıkarın ve ardından küçük makası kullanarak foramen magnumun her iki yanındaki kemikten iki yanal kesik yapın (Şekil 1, A1 ve A2 etiketli kesikler).
- Gözler arasında (bregmanın hemen önünde) başka bir kesi yapın (Şekil 1, B etiketli kesim), ardından sagital sütür boyunca öne doğru dikkatlice kesin ve beyni ortaya çıkarmak için kesilen kafatası bölümlerini yansıtın (Şekil 1, C etiketli kesim).
- Beyni çıkarmak ve bir kültür kabına yerleştirmek için küçük spatulayı kullanın. Beynin alt kısmındaki kraniyal sinirlerin kesilmesi gerektiğinin farkında olun, bu daha küçük boyutlu mikro spatula kullanılarak yapılabilir. Daha büyük bir spatula kullanarak, beyni kesme çözeltisi bulamacı ile doldurulmuş 25 ml'lik behere aktarın.
- Beyin yarım küresini dilimleme için hazırlamak.
- 6 cm'lik filtre kağıdının bir parçasını taze bir kültür kabının dibine yerleştirin, ardından taze kesme solüsyonu, bulamaç ve kabarcık ile doldurun. Beyni, ventral tarafı aşağı bakacak şekilde filtre kağıdına yerleştirmek için daha büyük spatulayı kullanın. Yeni ve temizlenmiş tek kenarlı bir tıraş bıçağı alın ve beyinciği çıkarmak için beyni kesin, ardından beyni iki yarım küreye ayırmak için orta hat boyunca bir kesim yapın.
- Vibratom doku bloğunun hazırlanması.
- Soğutulmuş vibratom doku bloğunu alın, yüzeyi kurutun ve ortasına bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin ve beynin yaklaşık boyutuna eşit şekilde yayın. Beyin yarım kürelerinden birini büyük mikro spatula üzerine manipüle etmek için küçük spatulayı kullanın, böylece beynin medial tarafı aşağı iner.
- Çözeltinin mümkün olduğunca fazlasını çıkarmak için ikinci filtre kağıdı parçasındaki beynin arayüzündeki spatulanın kenarına dokunun. Yapıştırıcının üzerine yönlendirmek için daha küçük spatulayı kullanarak beyni daha büyük spatuladan kaydırın.
- Kesme bloğunu vibratom haznesine sabitleyin ve hazneyi kesme solüsyonu bulamacı ve kabarcıkla doldurun, beynin tamamen daldırıldığından emin olun. Kesme bloğunu, beynin ventral tarafı bıçağa bakacak şekilde döndürün.
- Beyni dilimlemek.
not: Her vibratom benzersizdir, bu nedenle üreticinin talimatlarına uyun.
- Dilim kalınlığını 450 μm'ye ayarlayın ve bıçağın beyinde yaklaşık 0,3 mm/sn hızla hareket ederken titreştiğinden emin olun. Beynin ventral tarafından kortikal yüzeye kadar tamamen kesilmesi, bu, elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılabilecek tüm beyin sagital dilimleri üretecektir. Dilimler lateral ila medial olarak üretilecektir ve tipik olarak her yarım küreden 3-4 dilim kesilebilir.
- Dilimin tabanı kalkarsa, dilimi hafifçe aşağı bastırmak için bükülmüş 27 G iğneyi kullanın. Her dilim kesilirken, 8 saate kadar canlı kalacakları tutma odasındaki platforma taşımak için transfer pipetini kullanın.
3. Hücre Dışı Elektrofizyoloji Kayıtları
- Dilimi kayıt odasına monte etme.
- Transfer pipetini kullanarak, 1 - 2 ml/dk'da akan ve 32 °C'ye ısıtılan aCSF ile perfüze edilmiş batık bir kayıt odasına bir beyin dilimi yerleştirin. Kayıtlar için kullanılan aCSF, Mg2+ konsantrasyonu 2 mM'den 4 mM'ye yükseltildiği için tutma odasındakinden farklıdır.
- Dilimi bir "arp" (2-3 mm aralıklarla gerilmiş naylon şeritlere sahip yarı dairesel paslanmaz çelik) ile sabitleyin. Arpı, teller CA1'e paralel çalışacak şekilde yerleştirin. Perfüzyon hızını 32 ° C'de 8 - 10 ml / dk'ya yükseltin.
- Diseksiyon mikroskobu altında, CA1'in stratum radiatumunun yüzeyine bir uyarıcı elektrot ve bir kayıt elektrodu (aCSF kayıt solüsyonu ile doldurulmuş cam elektrot) yerleştirin (Şekil 2A). Önce uyarıcı elektrodu yerleştirin, ardından kayıt elektrodunu yerleştirin.
- Schaffer teminatlarını 120 - 150 μA genlik ve 0.1 msn süreli test darbesi ile uyarın ve dilim sağlığını belirlemek için ortaya çıkan alan uyarıcı post sinaptik potansiyel (fEPSP) dalga formunu gözlemleyin (Şekil 2B). Uyarıcı ve kayıt elektrotlarının, küçük bir fiber voleybolu ve büyük genlikli bir fEPSP kaydı elde etmek için dilim yüzeyinden yaklaşık 50 - 100 μm uzakta dilim içine taşınması gerekebilir. Schaffer teminatı uyarılmış fEPSP'ler stereotipiktir ve dilim sağlığının iyi bir göstergesidir. Sağlıklı dilimler tipik olarak 0,3'ten daha düşük bir lif voleybolu / fEPSP genlik oranı gösterir.
- Elektrotların yeniden konumlandırılması.
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, uyarıcı elektrodu stratum oriens'in ortasına hareket ettirin ve kayıt elektrodu, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, kayıt elektroduna mümkün olduğunca yakın piramidal hücre katmanına hareket ettirin. Uyarıcı ve kayıt elektrotlarının yaklaşık 50 - 100 μm'lik dilime itilmesi gerekebilir, böylece 120 - 150 μA test darbesine fEPSP yanıt genliği yaklaşık 1 mV'dir.
- γ salınımları oluşturma.
- γ salınımlar oluşturmak için, dokuyu 200 Hz'de verilen 20 x 0.1 msn darbeli bir trenle uyarın. Bu tetanik uyaran, her 5 dakikada bir verildiğinde tekrarlanabilir tepkiler verebilir.
- Aşağıdaki kayıt parametrelerini kullanın.
- Çıkış sinyalinin kazancını, analogdan dijitale dönüştürücünün giriş voltajı aralığıyla eşleşecek şekilde ölçeklendirin. Beklenen maksimum sinyal sapmasının giriş voltajı aralığının en az %30'unu kullandığından emin olun. Sinyaller kırpılabileceğinden, kazançları çok yükseğe ayarlarken dikkatli olun. Saha kayıtları için gereken tipik bant genişliği, temel kaymayı ortadan kaldırmak için 0,1 Hz'de AC kuplaj ile 500 Hz'dir.
- Sinyal örtüşmesini önlemek için alçak geçiren filtrenin köşe frekansından en az 4 - 5 kat daha hızlı sayısallaştırın.
