Bir farede retina pigment epitelinin doğrudan bağlı elektroretinogram kaydı

Özet

Kaynak: Miyagishima, K. J., et al. href="https://app.jove.com/v/61491"Doğrudan Bağlı Elektroretinogram (DC-ERG). J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, karanlığa uyarlanmış, anestezi uygulanmış bir fare retina pigment epiteli (RPE) üzerinde doğrudan bağlı bir elektroretinogramın (DC-ERG) kaydını göstermektedir. Dilatasyon damlaları uygulandıktan sonra, hayvan bir kayıt düzeneğine yerleştirilir ve bir tuz tamponu ile doldurulmuş kılcal elektrot kornea üzerine yerleştirilir. Referans değer oluşturulduktan sonra DC-ERG kaydedilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fare ve elektrot konumlandırma

1. Karanlığa uyum sağlamak için fareleri gece boyunca iyi havalandırılmış, ışık geçirmez bir kutuda tutun.
2. Hayvanlar intraperitoneal ketamin (80 mg/kg) ve ksilazin (8 mg/kg) enjeksiyonu ile uyuşturuldu.
3. Korneayı uyuşturmak için topikal olarak% 0.5 proparakain HCl'lik bir damla ve ayrıca öğrencileri genişletmek için% 2.5 fenilefrin HCl ve% 0.5 tropikalamid damlası uygulayın.
4. Kayıt sırasında yanlışlıkla seğirmenin cam kılcal elektrotları rahatsız etmesini önlemek için fare bıyıklarını makasla kesin.
   not: ERG sistemi içindeki Doğrudan Bağlı Elektroretinogram (DC-ERG) uyaran protokolü, Adım (ileri ok) veya Adım (geri ok) üzerine tıklanarak seçilebilen birkaç yerleşik uyaran rutinine sahiptir. DC-ERG kaydını hazırlamak ve gerçekleştirmek için yazılımdaki yalnızca Adım 1, 4 ve 5 gereklidir.
5. ERG sisteminde, yazılım doğru hastanın seçildiğini doğrular. Yeşil Protokoller düğmesine tıklayın. Protokol Açıklaması'nın altında DC-ERG'yi seçin. Ardından Çalıştır'a tıklayın. Evet'e tıklayarak bunun gerçekleştirilen doğru test olduğunu doğrulayın.
6. Empedanstaki değişiklikleri gözlemlerken fareyi ve elektrotları konumlandırmaya yardımcı olmak için kubbenin içindeki kırmızı ışığı açmak için Adım 1/6 olarak belirlenen Kırmızı Işık uyaranını kullanın.
7. Fareyi ısıtılmış bir kayıt masasına yerleştirin ve forseps kullanarak arka bacağın derisini dikkatlice örtün. İğne elektrodunu bir elinizle sıkıca tutun ve yerine sabitlemek için deri altından arka bacağa yerleştirin.
8. Referans Gümüş/Siverklorür(Ag/AgCl) elektrodunu (Malzeme Tablosu) ağzın içine, sinterlenmiş pelet arka yanak boyunca dayanacak ve dişlerin arkasında yerinde tutulacak şekilde yerleştirin.
   not: Altın tel elektrotlar, farklı empedans özelliklerine sahip oldukları ve tepeden tepeye gürültüyü artırdıkları için ağız referans elektrodu olarak kullanılmamalıdır.
9. Kılcal elektrotları farenin gözüne yerleştirmeden önce, elektrot tutucuyu cam kılcal damarlarla dikey olarak tutun ve sokulmuş olabilecek kabarcıkları çıkarmak için elektrot tutucuyu işaret parmağınızla hafifçe vurun. Bir şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğne kullanarak ucu Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile doldurun ve uçta sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olmak için inceleyin. Elektrot tutucu standını, HBSS dolu kılcal damarların açık ucu kornea ile hafif temas halinde olacak şekilde konumlandırın.
10. Kayganlaştırıcı göz jel dağıtıcısını ters tutarak ve ilk damlaları atarak hava kabarcıklarının girmesini önlemek için özel önlemler alın. İletkenliği korumak ve kayıt sırasında kurumayı önlemek için her göze bir damla kayganlaştırıcı göz jeli sürün.

2. DC-ERG kaydı

1. Adım 4/6 "Uzun Flaş No-Li"yi seçmek için Adım'a (ileri ok) tıklayın.
2. Empedans'a tıklayın. Sol ve sağ gözlerin dirençlerini incelemek için Empedans Kontrolü ekranını kullanın. Her bir gözdeki kayıt elektrotları için empedans değerlerinin benzer olması beklenir (~ 39 kΩ). Toprak ve referans elektrotları için empedans değerlerinin 10 kΩ'dan düşük olması beklenir).
3. Sol ve sağ gözün izlerini görüntülemek için Önizleme'ye tıklayın. Stabil bir taban çizgisine ulaşılmasını bekleyin (<10 dk). İzlemeden çıkmak için Durdur'a tıklayın preview.
   not: Kayıttaki sapma yönündeki ani değişiklikler veya anormal gürültü zamanla düzelmeyecek ve dikkat edilmesi gereken kılcal elektrotun tanımlanmasını gerektirecektir. En olası neden, elektrotun ucuna giren bir kabarcıktır. Ucu HBSS ile tekrar doldurun. Taban çizgisini kontrol etmek için tekrar Önizleme'ye tıklayın.
4. Adım 5/6 "Uzun Flaş 10 cd 7 dakika"yı seçmek için Adım'a (ileri ok) tıklayın. Kaydı başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ag/AgCl (ağız) Elektrodu	WPI Inc	EP1 (İngilizce	Fare için ağız referans elektrodu
Seramik Karo	Sutter Enstrümanı	Cts	Cam kılcal boruyu uygun bir boyutta kesmek için kullanılır
Pamuk Uçlu Temizleme Çubuğu	Püriten Tıbbi Ürünler	867-WC Tutkal Yok	Elektrot tutucu tertibatının uyumunu iyileştirmek için ara parça olarak kullanılmak üzere
Elektroretinogram (ERG) Sistemi	Teşhis LLC	E3 Sistemi	Görme araştırmalarında ve ilaç denemelerinde oftalmik durumları teşhis etmek için görsel elektrofizyoloji sistemi
Bunsen Brülör	Argos Teknolojileri	BW20002460	Veya alev altında camı şekillendirmeye eşdeğer
Cam Kılcal Boru (1.5 mm)	Sutter Aletleri	BF150-75	HBSS ile doldurmak ve korneaya temas etmek için
Hank'in Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS)	Thermo Fisher Bilimsel A.Ş	14175-095	Piyasada. RT'de koruyun
Hat İçi Filtre	Ne adam	6722-5001	Vakum pompasını aerosollerden korumak için
Mikroelektrot Tutucular için Düşük Gürültülü Kablo	WPI Inc	5372	Kabloların ve elektrot tutucu tertibatlarının uzunluğunu ve yerleşimini iyileştirmek için önerilir
Manyetik Rotil	WPI Inc	500871	Elektrot tutucu tertibatını sahneye manyetik olarak yerleştirmek için
MatLab Laboratuvarı	Matematik Çalışmaları		MatLab: Analiz yazılımını düzenlemek için
Matlab Curvefit Araç Kutusu	Matematik Çalışmaları		Toolbox for MatLab (yalnızca analiz yazılımını düzenlemek için gereklidir)
MatLab Derleyicisi	Matematik Çalışmaları		Toolbox for MatLab (yalnızca analiz yazılımını düzenlemek ve yeniden yayınlamak için gereklidir)
MatLab Çalışma Zamanı sürüm 9.5	Matematik Çalışmaları	R2018b (9.5)	Analiz yazılımını çalıştırmak için gereklidir: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Mikroelektrot Tutucular (45 derece)	WPI Inc	MEH345-15	Kılcal damarları tutmak için
İğne (25 ga)	Covid (Türkçe)	8881250313	Kılcal boruları HBSS ile doldurmak için
İğne (toprak) elektrodu	Ritim bağlantısı	13mm - bir elctrode	Fare için subdermal iğne elektrodu (topraklanmış) (13 mm uzunluğunda, 0,4 mm çapında iğne, 1,5 m kurşun tel)
Regülatör/Güç Düzenleyici	Furman	P-1800	Veya güç hattından gelen gürültüden DC ofsetini çıkarmak için eşdeğer
Şırınga (12 mL)	Monoject	1181200777	Kılcal boruları HBSS ile doldurmak için
T klipsi	Cole-Parmer	06852-20	Elektrot tutucu montajı için
Vakum Kurutucu	Bel-Sanat	420120000	Şeffaf polikarbonat alt kısım ve kapak
Farmakolojik tedavi
Kayganlaştırıcı göz jeli	Alcon	0078-0429-47	Kornea yüzeyini yağlamaya ve kılcal elektrotlarla elektrik temasını sürdürmeye yardımcı olur
Fenilefrin Hidroklorür% 2.5	Akorn Belediyesi	17478-201-15	Kısa etkili midriatik göz damlası (göz bebeği genişlemesi için)
Proparakain Hidroklorür% 0.5	Akorn Belediyesi	17478-263-12	Oftalmik damlatma için lokal anestezik
Tropikanamid %0.5	Akorn Belediyesi	17478-101-12	Kısa etkili midriatik göz damlası (göz bebeği genişlemesi için)
Ksilazin	AnaSed	sc-362949Rx	Analjezik ve kas gevşetici
Zetamin (Ketamin HCl)	Veteriner Bir	501072	Kas içi enjeksiyonlar için anestezik

) Serisi . sayılı Kanun Hükmünde Kararname Dersi Serisi