Drosophila Sensilla'dan Uçucu Koku Maddelerine Yanıt Olarak Elektrofizyolojik Kayıtlar

Özet

Kaynak: Ng, R., et al. Düşük uçuculuğa sahip koku maddelerine yanıt olarak Drosophila Trichoid sensilla'dan elektrofizyolojik kayıt. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, canlı bir Drosophila sineği elektrofizyolojik çalışmalar için bir tüpe monte edilmiştir. Elektrotlar, sineğin koku alma reseptör nöronları ile feromonlara spesifik nöronal tepkileri kaydetmek için sensillumun tabanına yerleştirilir.

Protokol

1. at4 Kaydı için Donanımın Hazırlanması

1. Alüminosilikat cam kılcal damarlara (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm) sahip elektrotları hazırlamak için bir pipet çektirme aleti kullanın. Sineğin clypeus'una (yani, sinek kafasının önünde, ağız parçalarının üzerinde yuvarlak bir plaka) yerleştirmeyi kolaylaştırmak için referans elektrodun ucunu bir çift ince forseps ile hafifçe köreltin.
   NOT: Bu çalışmada 7 günlük WT(Wild tip) erkekler (Berlin) kullanıldı. Her iki elektrot için elektrolit olarak AHL salin solüsyonu kullanın.
2. 900 mL damıtılmış suyu 6.312 g NaCl, 0.373 g KCl, 0.337 g NaHCO₃, 0.1120 g NaH₂PO₄, 1.892 g Trehaloz ּ2H₂O, 3.423 g sakaroz, 1.192 g HEPES (N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit) ile karıştırarak 1 L AHL (Yetişkin Hemolenf Benzeri) hazırlayın, ve 8.2 mL 1M MgCl₂. Damıtılmış su kullanarak, toplam hacmi 1 L'ye getirin 1 N NaOH kullanarak pH'ı 7.4'e getirin ve çözeltiyi vakumla çalışan bir filtre sistemi ile sterilize edin. Uzun süreli depolama için AHL alikotlarını 4 °C.
   'de tutun NOT: Palmitoleik asidin tutarlı dağıtımları, kartuşlar arasındaki homojenliğe bağlıdır. Her kartuş tekrarlanabilir bir şekilde monte edilmelidir.
3. Bir tıraş bıçağı kullanarak, 4,1 cm ölçülerindeki ilk kartuş bölümünü oluşturmak için 200 μL'lik bir pipet ucunun ucundan 0,9 cm çıkarın; Şekil 1A'da ayrıntılı olarak açıklanan boyutlara bakın. Başka bir 200 μL pipet ucu kullanın ve ikinci kartuş bölümünü oluşturmak için uçtan ve tabandan 1,7 cm ve 1,5 cm çıkarın, 1,8 cm ölçülerinde (Şekil 1A). Tekrarlanabilirliği sağlamak için bir cetvel kullanın.
4. Filtre kağıdından diskleri kesmek için 1/8" delgeç kullanın.
5. İkinci kartuş bölümünün ucuna bir filtre kağıdı diski yerleştirmek için forseps kullanın. Kartuş ucunda havanın geçebileceği bir açıklığı görsel olarak onaylayın.
6. Birinci ve ikinci kartuş bölümlerini Şekil 1A'da gösterildiği gibi takın. Hazırlığa kare hedeflemeyi kolaylaştırmak için ikinci kartuş bölümünü aşağı doğru eğin (Şekil 1B).
7. Kartuşu bir mikromanipülatöre monte edilmiş koku verme tüpüne bağlayın.
   NOT: Bu tasarım, değişimi kolaylaştırmak için kartuşun dışa doğru döndürülmesine izin verir (Şekil 1C).
8. Sabit nemlendirilmiş hava akışını bir kütle kontrol cihazında 2 L/dk'ya ve koku verici akışını başka bir kütle kontrol cihazında 500 mL/dk'ya ayarlayın.
9. Yazılımı kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), 500 ms'lik bir koku püskürtücüsü uygulamak için prosedürü programlayın.

2. Teslimat için Palmitoleik Asit Koku Çözeltilerinin Hazırlanması

NOT: OR47b ORN'ler hem cis- hem de trans-palmitoleik aside yanıt verir. Palmitoleik asit RT'de kararsız olduğundan, stoklar -20 °C'de depolanır ve açıldıktan sonra bir ay içinde kullanılır. Etanol, palmitoleik asit için tercih edilen çözücüdür.

1. 1.7 mL mikrotüplerde on kat seri seyreltmeler için 10 μL cis- veya trans-palmitoleik asit stoklarını veya seyreltmelerini 90 μL %100 etanol ile iyice karıştırmak için bir vorteks karıştırıcı kullanın. Deneylerden önce günlük olarak taze palmitoleik asit seyreltmeleri hazırlayın ve bir gün içinde kullanın.
   NOT: Etanolde çözünmeyen koku maddeleri için, diğer organik çözücü türleri ile koku seyreltmeleri hazırlamak için bir cam şişe önerilir.
2. Bir P10 mikropipet kullanarak, istenen seyreltmelerden 5 μL cis-palmitoleik asit çözeltilerini ilgili her kartuştaki filtre kağıdına uygulayın.
   NOT: En yüksek dozaj (^10-1) 450 μg bileşik içerir. Trans-palmitoleik asit çözeltileri için, en yüksek dozaj (^10-1) 450 μg bileşik içerecek şekilde bunun yerine 4.5 μL uygulayın.
3. Çözücüyü tamamen buharlaştırmak için palmitoleik asit kartuşlarını RT'de ve 7.59 mmHg basınçta 1 saat boyunca bir vakumlu desikatöre yerleştirin.
   NOT: Kartuşlar RT'de 4 saate kadar kullanılabilir.

3. In Vivo Elektrofizyolojik Kayıtlar için at4 Sensilla'ya Hazır Erişim için Drosophila'nın Hazırlanması

>NOT: WT sinekleri (Berlin), standart mısır unu ortamında 25°C'de 12:12 aydınlık-karanlık döngüsünde yetiştirilir. Eklosiyon üzerine, sinekler cinsiyetlerine göre on kişilik gruplara ayrılır, böylece 7 günlük yaşa kadar grup halinde barındırılırlar. Hem erkek hem de dişi sineklerde OR47b ORN'ler (Koku Reseptör Nöronları) palmitoleik aside yanıt verir. Basitlik açısından, bu çalışmada sadece erkek sinekler incelenmiştir.

1. Bir sinek hazırlama slaytı monte edin: bir cam slayt üzerine, az miktarda modelleme kili üzerine bir cam lamel (18 x 18 mm2) yerleştirin ve cam slaytla ~3°'lik bir açı oluşturun. Lamelin iç kenarına ve hemen altındaki slayt alanına çift taraflı bant yerleştirin. Kaydın her günü için yeni bantla değiştirin (Şekil 2A).
2. Hortumdaki ilgilenilen sineği toplamak için bir sinek aspiratörü15 kullanın ve ardından borunun ucuna 200 μL'lik bir pipet ucu takın. Aynı anda, sineği pipet ucunun ucuna itmek için içine hava üflerken tüpü ileri doğru itin. Sineğin vücudunun hemen altını ve sineğin 2 kafa boyu üstünü kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
3. Pipet ucunun altını modelleme kili ile sıkıştırın, hem anten hem de clypeus açığa çıkana kadar sineği yukarı doğru itin (Şekil 2B). Sineği öldürmekten kaçınmak için, sineğin karnının ezilmesini önlediği için anteni ve aristaları açığa çıkaracak kadar kil ekleyin. Ayrıca, herhangi bir ani daralmayı önlemek için kili yavaş ve nazikçe ekleyin. Anten veya hortum hareketini kontrol ederek sineğin canlı olduğunu onaylayın.
4. Sineği barındıran pipet ucunu hareket ettirmek için forseps kullanın. Başını, clypeus gözlemcinin sağına bakacak şekilde yönlendirin. Antenin yan tarafı bantlanmış lamel yüzeyine dayanana kadar ince forseps kullanarak lamel boyunca hazırlığı ayarlayın (Şekil 2B).
5. Hareketi önlemek için anteni çift taraflı banda sabitlemek için arista'ya bir tutma çubuğu yerleştirin (Şekil 2B).
   NOT: Tutma çubuğu, bir pipet çektirmesi ile bir borosilikat cam kılcaldan çekilir ve modelleme kili ile yerinde tutulur (Şekil 2A).
6. Hazırlığı teçhizatın tablasına yerleştirin (Şekil 2C). Mikroskobu kullanarak, trikoidin antenin üçüncü segmentinin distal-lateral kenarı boyunca görünür olduğunu doğrulayın.
   NOT: Sensilla, tanımlamalarını basitleştirecek ve kaydı kolaylaştıracak şekilde arka plana karşı siluet haline getirilmelidir (Şekil 3). Bu hazırlıkta, en erişilebilir trikoid sensilla at4 tipindedir.
7. Daha önce açıklandığı gibi, 2, 15, hazırlığı, hazırlıktan yaklaşık 2 cm uzakta ayrı bir hava dağıtım tüpü aracılığıyla verilen sabit nemlendirilmiş hava akışı (2 L / dak) altında tutun (Şekil 4).

4. Palmitoleik Aside Yanıt Olarak at4 Trichoids'deki Or47b ORN'lerden at4 Sensillum Aktivitesinin Kaydedilmesi

1. Referans elektrodu clypeus'a yerleştirin (Şekil 3A). Hızlı ve pürüzsüz bir hareketle, elektrotun doku hasarını önlemek için kütikül altındaki hemolenf ile temas edebileceği yüzeyin hemen altına yerleştirildiğinden emin olun.
2. Kayıt elektrodunu, hedef sensillum ile aynı görüş düzlemine girene kadar yavaşça indirin (Şekil 3B). 50X objektif lens altında kayıt yapın.
   not: Sert trikoidal kütikül, kayıt elektrodun, daha geniş alanı elektrotun saptırılma olasılığını azaltan daha büyük bir hedef sağlayan sensillar tabana yerleştirilmesini gerektirir (Şekil 3B, iç).
3. Bir sensilluma koku uyaranları uygulamadan önce, aşağıdaki seçim kriterlerine dikkat edin: bu standartları karşılamayan herhangi bir trikoid reddedilmeli ve bunun yerine başka bir sensillum seçilmelidir.
   1. Yüksek bir sinyal-gürültü oranı gözlemleyin (örnek için Şekil 3C'ye bakın).
   2. at4A ve at4C nöronlarından tanımlanabilir ani artışları gözlemleyin (Şekil 3C).
      NOT: at4B spike genliği, at4A10'a çok benzer görünür ve koku uyarımı olmadan kolayca tanımlanamaz.
   3. at4A nöronlarının bazal ateşleme hızının 20 Hz.
      civarında veya altında olduğunu gözlemleyin NOT: Bu kriter at4A için spesifiktir çünkü nöron için bazal ateşleme hızı bazikonik ORN'lerinkinden daha yüksektir. Çok daha yüksek bir bazal ateşleme, elektrot yerleştirme sırasında nöronların hasar görmüş olabileceğini gösterir.
4. Kartuşu koku verici dağıtım tüpüne bağlayın. Solvent kontrolü ve ardından düşük konsantrasyonlardan yüksek konsantrasyonlara kadar koku verici maddelerle başlayın. Kartuşu hazırlığın başına tam olarak doğrultarak kartuşu hazırlığa doğru manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın. Kartuşun birkaç milimetre uzaklıktan doğrudan antene (Şekil 4) doğrultulduğunu görsel olarak onaylayın.
   NOT: Amaç, kartuşun açıklığını doğrudan antene yönlendirmek ve hedef dokuya yakın bir yere yerleştirmektir.
5. Koku verici kartuşunun sağındaki kayıt elektrodundan 1 - 2 mm ve aşağıdaki sinek hazırlama sürgüsünden yaklaşık 1 mm ayrıldığından emin olun.
   not: Burada açıklanan kurulumda, koku verici kartuşu kayıt elektrodu, referans elektrodu ve sinek hazırlama sürgüsü ile yakından sınırlanmıştır (Şekil 4).
   NOT: Kartuş ile kayıt/referans elektrotları arasındaki mesafeyi göz önünde bulundurun. Yaklaşık 4 mm'lik bir mesafe önerilir. İstenmeyen temas, sinyali sonlandırabilir ve kayıt elektrodunun ucunu kırabilir, mevcut nörona zarar verebilir ve daha fazla kaydı zorlaştırabilir.
   NOT: Kartuş ile sinek hazırlama sürgüsü arasındaki mesafeyi göz önünde bulundurun. Lameli dokunmak da kayıt elektrodunu yerinden çıkararak kaydı bozabilir.
6. Kayda başlamak için veri toplama yazılımındaki "Kaydet"e basın.
   NOT: Her 10 s'lik kayıt için, adım 500'da açıklandığı gibi doğrudan antene 1.9 ms'lik tek bir koku darbesi iletilir.
7. Koku verici uygulandıktan sonra, bir sonraki en yüksek konsantrasyondaki bir kartuşla değiştirmeden önce kartuşu dikkatlice geri çekin. Tüm dozaj aralığı elde edilene kadar devam edin.
   NOT: Adaptasyonun olası etkilerinden kaçınmak için her sinekten yalnızca bir OR47b ORN'nin kaydedilmesi önerilir.
8. Gün boyunca kaydı bitirdikten sonra kayıt elektrodunu damıtılmış suyla iyice durulayın.
9. Piyasada bulunan çevrimdışı analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin ve çizin.

Sonuçlar

Şekil 1: Kartuş ve Olfaktometre Kurulumu. (A) Koku kartuşlarının hazırlanması. Soldan sağa: standart 200 μL'lik pipet ucu, birinci ve ikinci kartuş bölümleri ve tamamlanmış bir koku kartuşu. (B) Olfaktometreye bağlı, ikinci bölümün aşağı doğru açısını gösteren kartuş. (C) Bağlı bir koku verici kartuşu ile mikromanipülatöre monte edilmiş koku verme tüpünü gösteren olfaktometre kurulumu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hazırlık Kurulumu ve Çeşitli Malzemeler
Pipet Çektirme Aleti	Sutter Aletleri, Novato CA ABD	P97 Serisi	Pipet Çektirme
Borosilikat Cam Kılcal Damarlar	Dünya Hassas Aletler, Sarasota FL ABD	1B100F-4	tutma çubukları yapmak için
Alüminosilikat Cam Kılcal Damarlar	Sutter Instruments, Novato CA ABD	AF100-64-10	elektrot yapmak için
Superfrost Mikroskop Slaytları	Fisher Scientific, Pittsburgh PA ABD	12-550-143	Fly-Prep istasyonu için
Kalıcı Çift Taraflı Bant	İskoç St. Paul MN Amerika Birleşik Devletleri	Na	Fly-Prep istasyonu için
Dik mikroskop	Olimpos, Shinjuku Tokyo Japonya	BX51	kayıt teçhizatı için
Plastalina modelleme kili	Van Aken, Kuzey Charleston SC Amerika Birleşik Devletleri	B0019QZMQQ	hazırlık istasyonu ve tutma çubuğunu stabilize etmek için
SFCA Membranlı Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Ünitesi, 0,45 mm	Nalgene, Rochester NY Amerika Birleşik Devletleri	# 156-4045	AHL çözeltisini sterilize etmek için
200 μL pipet ucu	VWR Radnor, PA Amerika Birleşik Devletleri	53508-810	Koku kartuşları yapmak ve sinek hazırlığı yapmak
Filtre Kağıdı	Whatman, Maidstone Kent İngiltere	740-E	koku kartuşları yapmak için
Vakum Kurutucu	Cole-Parmer, Vernon Hills IL Amerika Birleşik Devletleri	VX-06514-30	etanol çözücüyü buharlaştırmak için
cis-palmitoleik asit	Cayman Kimyasal, Ann Arbor MI ABD	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Or47b koku verici
trans-palmitoleik asit	Cayman Kimyasal, Ann Arbor MI ABD	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Or47b koku verici
etanol	Spektrum Kimyasal MFG. New Brunswick NJ ABD	E1028-500MLGL	palmitoleik asidi seyreltmek için
Koku Kartuşu Mikromanipülatörü	Siskiyou, Hibeler Geçişi VEYA ABD	MX130R Serisi	OLFAKTOMETREYİ konumlandırmak için
Flow Vision yazılımı	Alicat, Tuscon AZ Amerika Birleşik Devletleri	AKIŞ VİZYONLARI	Akış hızını kontrol etmek için yazılım
Kütle Kontrol Cihazı	Alicat, Tuscon AZ Amerika Birleşik Devletleri	MC-2SLPM-D	Nemlendirilmiş havanın akış hızını kontrol etmek için
Kütle Kontrol Cihazı	Alicat, Tuscon AZ Amerika Birleşik Devletleri	MC-500SCCM-D	koku stimülasyonu için akış hızını kontrol etmek
Kelepçe	Moleküler Cihazlar, Sunnyvale CA ABD	Ayet 10.4	Veri toplama yazılımı
Hava dağıtım tüpü	Ace Glass, Vineland NJ ABD	8802-936	Nemlendirilmiş hava sağlamak için
50X objektif mercek	Olimpos, Shinjuku Tokyo Japonya	LMPLFL50X	kayıt teçhizatı
Kelepçe 10	Moleküler Cihazlar, Sunnyvale CA ABD	Ayet 10.4	Spike analizi için yazılım
Igor Pro 6	WaveMetrics, Oswego Gölü VEYA ABD	Ver. 6.37	Veri analizi için yazılım
Ses Monitörü	ALA Bilimsel Aletler, Farmingdale NY ABD	NPIEXB-AUDIS-08B	Aural olarak bireysel ani artışları bildirir
Hücre Dışı Amplifikatör	ALA Bilimsel Aletler, Farmingdale NY ABD	NPIEXT-02F	elektrik sinyallerinin genliğini artırmak için
Valf Kontrol Cihazı	Warner Enstrümanları	VC-8	Koku stimülasyonu için valfin açılmasını kontrol etmek için
Kayıt Elektrodu Mikromanipülatörü	Sutter Instruments, Novato CA ABD	MP-285	Kayıt elektrodunu konumlandırmak için
Sahne Başı Amplifikatörü	ALA Bilimsel Aletler, Farmingdale NY ABD	EQ-16.0008	elektrik sinyallerinin genliğini artırmak için
Osiloskop	Tektronix, Beaverton VEYA ABD	TDS2000C	Bireysel ani artışların görsel raporu

Serisi Serisi Serisi için Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi