Bir Fare Beyin Kaması Diliminde İşitsel Sinir Kökü Stimülasyonu ve postsinaptik akım kayıtları

Özet

Kaynak: Fischl, M. J., et al. In Vivo Nöronal Devre Bağlantısını Taklit Etmek için In Vitro Kama Dilimi Hazırlığı. J. Vis. Uzm.(2020)

Bu video, fare beyni kama dilimlerinde medial olivokoklear nöronlarda işitme sinir kökünü uyarmak ve postsinaptik akımları kaydetmek için bir protokolü göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Elektrofizyoloji kurulumu ve kaydı

1. Kama dilimini kayıt odasına yerleştirin ve dilimi bir arp veya dengeleme sistemi ile sabitleyin. Karbojen ile köpürtülmüş ılık (35 ° C) ACSF ile dokuyu 7-10 mL / dk hızında sürekli olarak perfüze edin.
2. Yama kelepçesi kayıtları için 561 nm emisyon filtreli epifloresan kullanarak yamuk cisim VNTB'nin ventral çekirdeğindeki genetik olarak etiketlenmiş medial olivokoklear MOC nöronlarını tanımlayın. Potansiyel olarak yama yapılabilir hücre yoksa dilimi çevirin.
3. DIC optiklerini kullanarak, dilimin kalın tarafındaki işitsel sinir köküne odaklanın ve bipolar tungsten uyarıcı elektrodu işitsel sinir köküne ve nazikçe doku yüzeyine hareket ettirmek için bir mikromanipülatör kullanın.
   not: Emme elektrotları diğer laboratuvarlarda işitsel sinir stimülasyon deneylerinde kullanılmıştır. Diğer spesifik preparatlara uygulanabilirse, teta cam elektrotlar veya optik stimülasyon yöntemleri kullanılabilir.
4. Yama kelepçesi elektrofizyolojisi için hedeflenecek bir MOC nöronu seçmek için görüş alanını VNTB'ye geri taşıyın.
5. Bir kayıt pipetini önerilen deney için uygun bir dahili çözelti ile doldurun.
6. Tüm hücre konfigürasyonunda MOC nöronundan yama ve kayıt yapın. Gerekirse membran kapasitansını ve seri direnci telafi edin.
7. MOC nöronunda tutarlı postsinaptik olaylar elde etmek için işitsel sinir kökünün elektriksel stimülasyon genliğini ayarlayın.
   not: Stimülasyon elektrodunu hareket ettirmek gerekebilir.
8. MOC'de (voltaj kelepçesi) uyarılmış sinaptik akımları gözlemlemek için uygun stimülasyon protokollerini çalıştırın.
   not: Kama dilimi hazırlığı, gevşek yama kayıtları, farmakoloji, optogenetik, kalsiyum görüntüleme, nörotransmitter açma vb. gibi herhangi bir tipik yama kelepçesi aletiyle kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
A1R Dik Konfokal Mikroskop	Nikon Enstrümanları		Elektrofizyoloji ve görüntüleme mikroskobu, elektrofizyoloji ile uyumlu herhangi bir mikroskop olabilir
Elektrot Borosilikat cam, Filament OD 1,5 mm, ID 1,1 mm, 10 cm uzunluğunda	Sutter Enstrümanı	BF150-110-10	Yama sıkıştırma pipet camı
Elektrot Dolgusu MicroFil	TEFE	CMF20G (İngilizce)	Yama elektrot pipet dolgusu
Hat içi çözelti ısıtıcısı	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Dilim perfüzyon sistemi ısıtıcısı
Çoklu Mikromanipülatör Sistemleri	Sutter İzinsiz Girişleri	MP285 ile MPC-200	Yama kelepçesi ve stimülasyon elektrodu yerleştirme için mikromanipülatörler
Cam mikropipetler için P-1000 yatay pipet çektirmesi	Sutter çalgıları	FG-P1000	Yama kelepçesi pipetleyici çektirmesi
Yama kelepçesi amplifikatörü ve Yazılımı	HEKA (Türkçe	EPC-10 / Yama Yöneticisi Sonraki	Herhangi bir amplifikatör/yazılım olabilir
Kayıt Odası	Warner Enstrümanları	RC26G	Kayıt sırasında "banyo" dilimi
Kayıt Odası Arpı	Warner Enstrümanları	640253	Elektrofizyolojik kayıt sırasında dilimi sabitler
Dilim Kuluçka Odası	Özel Yapı		Dilimleme sonrası geri kazanım sırasında dilimler için ısıtılmış, oksijenli tutma odası
Uyaran izolasyon ünitesi	A.M.P.I.	Iso-Esnek	Elektrofizyoloji için uyaran izolasyon ünitesi
Şırınga 60CC	Fischer Scientific (Alışveriş İçi Ürünler)	14-820-11	Elektrofizyoloji perfüzyon sıvısı kullanımı
Sıcaklık kontrolörü	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Dilim perfüzyon sistemi sıcaklık kontrolörü
Boru: 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (Alışveriş İçi Ürünler)	14-171-129	Elektrofizyoloji perfüzyon sıvısı kullanımı
Tugsten konsantrik bipolar mikroelektrot	TEFE	TM33CCINS	Elektrofizyoloji için uyarıcı elektrot

Serisi )