Bir Sıçan Hipokampal Diliminde CA3-CA1 Sinaptik Yanıtlarının Kaydedilmesi

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. CA3-CA1 Sinaptik Yanıtlarının Kaydedilmesi

NOT: Alan potansiyeli kaydı için kullanılan elektrofizyoloji kurulumu Şekil 1A'da gösterilmiştir. Elektrik ayarlarının uygun şekilde topraklanmasından sonra elektriksel parazit kontrolün dışındaysa, bir Faraday kafesi şiddetle tavsiye edilir. Birçok farklı tipte batık ve arayüz odası ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, dilimler içlerinde daha sağlam sinaptik tepkiler sergilediği için arayüz odaları tercih edilir.

1. Elektrotların yerleştirilmesi
   1. Kullanılacak elektrikli cihazı (uyarıcılar ve amplifikatörler) açın. Uyarıcı ve kayıt elektrotlarını mikromanipülatörlerin pleksiglas tutucularına monte edin ve sabitleyin.
      not: Hem uyarucu hem de kayıt amaçlı olarak monopolar, lake kaplı, 5 MΩ dirençli paslanmaz çelik elektrotlar kullanıyoruz.
   2. Kullanmadan önce, bu elektrotları çekilen cam kılcal damarların içine yerleştirin ve elektrot ucunun sadece küçük bir kısmını açığa çıkaracak şekilde epoksi yapıştırıcı ile sabitleyin (Şekil 1E). Bu, aksi takdirde ince olan elektrotlara güç verir ve bunların elektrot tutucularına sıkıca sabitlenmesine yardımcı olur.
   3. Mikroskop altında yönlendirildiğinde, alan-EPSP (fEPSP) yanıtlarını kaydetmek için Schaffer kollateral liflerini ve kayıt elektrodunu CA1'in apikal dendritik bölgesinde uyarmak için uyarıcı elektrotları CA1 bölgesinin stratum radiatumuna yerleştirin.
      not: Elektrotlarla dilimin üzerindeki sıvı yüzeyine yaklaşmak, dilimin yüzeyinin hızlı bir şekilde bulunmasına yardımcı olan bir ses verir (amplifikatörün bir hoparlöre bağlı olması şartıyla).
   4. Sinaptik etiketleme ve yakalama deneylerinde, deneyin ihtiyacına göre, iki veya daha fazla bağımsız ancak örtüşen girişi uyarmak için kayıt elektrodunun her iki tarafına iki veya üç uyarıcı elektrot (S1, S2 veya S3) yerleştirin. Uyarıcı ve kayıt elektrotlarını yaklaşık 200 μm aralıklarla yerleştirin.
   5. Gerekirse, popülasyon artışını kaydetmek için stratum pyramidale katmanında başka bir kayıt elektrodu bulun (Şekil 2A). Her iki elektrot da dilime dokunduğunda, toplama yazılımını kullanarak, uygun bir fEPSP sinyali sağlamak için bir test stimülasyonu verin.
      not: Test stimülasyonu için iki fazlı, sabit akım darbeleri (darbe süresi 0,1 msn/yarım dalga) kullanıyoruz.
   6. Uygun bir fEPSP sinyali elde edildikten sonra, manipülatörlerin ince hareket düğmelerini kullanarak elektrotları yaklaşık 200 μm derinliğe dikkatlice indirin. Dilimlerin iyileşmesi için 20 dakika bekleyin.
2. Giriş-çıkış ilişkisi
   1. Bir dizi akım yoğunluğunda eğim değerini ölçerek her giriş için giriş-çıkış ilişkisini (afferent stimülasyona karşı fEPSP eğimi) belirleyin. Bunu 20 μA ila 100 μA arasında gerçekleştirin. Ardından, maksimum fEPSP eğiminin %40'ını elde etmek için her giriş için stimülasyon yoğunluğunu ayarlayın. Bunu deney boyunca sabit tutun.
   2. 15-20 dakika sonra taban çizgisini kaydetmeye başlayın. Bu süre zarfında fEPSP eğimini yakından izleyin ve eğim ayarlanan değerden %10'dan fazla dalgalanırsa uyaran yoğunluğunu sıfırlayın ve yeni bir referans değer başlatın. Devam etmeden önce en az 30 dakika veya 1 saat kararlı taban çizgisi kaydedin.
      not: Test veya temel stimülasyon için, her 5 dakikada bir verilen 0,2 Hz bifazik, sabit akım darbeleri (polarite başına 0,1 milisaniye) dört tarama kullanıyoruz. Bu dört yanıtın ortalama eğimi daha sonra bir tekrar olarak kabul edilir. Sinyaller bir diferansiyel amplifikatör tarafından filtrelenir ve güçlendirilir, analogdan dijitale dönüştürücü kullanılarak sayısallaştırılır ve özel yapım yazılımla çevrimiçi olarak izlenir.

Şekil 1.(A) stimülatörler, (b) bir diferansiyel amplifikatör, (c) bir analogdan dijitale dönüştürücü (d), Osiloskop (e), edinme yazılımına sahip bir bilgisayar, (f) Titreşime dayanıklı masa üstü (g), >4x büyütmeli mikroskop, (h) arayüzlü beyin dilimi odası, (i) ACSF ve karbojen kaynağı için bir perfüzyon sistemi, (j) sıcaklık kontrolörü (k) bir aydınlatma kaynağı (l), elektrot tutuculu manipülatörlerden oluşan alan potansiyeli kayıtları için elektrofizyoloji kurulumu. (B) Arayüz beyin dilimi odası. (C) & (D) Arayüz odasındaki hipokampal dilimler. (E) Cam kılcal damar içine kapatılmış paslanmaz çelik elektrot.

Şekil 2.(A) Alan potansiyeli kaydı için enine hipokampal dilimin ve elektrot konumunun şematik gösterimi: Bu gösterimde, iki uyarıcı elektrot (S1 ve S2), CA1 piramidal nöronlara iki bağımsız ancak örtüşen sinaptik girişi uyarmak için CA1 bölgesinin stratum radiatumuna yerleştirilir. Biri apikal dendritik bölmeden alan-EPSP (uyarıcı post-sinaptik potansiyel) kaydetmek ve diğeri piramidal hücre gövdelerinden somatik popülasyon artışını kaydetmek için olmak üzere iki hücre dışı kayıt elektrotu, sırasıyla stratum radiatum ve stratum pyramidale'de bulunur. CA1- cornu ammonis bölge 1, CA3- cornu ammonis bölge 3, DG- dentat girus, SC- Schaffer kollateral lifleri, S1- uyarıcı elektrot 1, S2-uyarıcı elektrot 2. (B) STC'yi incelemek için güçlü paradigmadan önce zayıf: Erken LTP'yi indüklemek için S1'e (açık daireler) zayıf tetanizasyon (WTET) uygulanır ve ardından geç LTP'yi indüklemek için 30 dakikada S2'nin (dolu daireler) güçlü tetanizasyonu (STET) uygulanır. S1'deki erken LTP, etiketleme ve yakalama etkileşimini gösteren geç LTP ile güçlendirilir (n = 6). (C) Çapraz etiketlemeyi incelemek için güçlü paradigmadan önce zayıf: Erken LTP, S1'de (açık daireler) WTET tarafından indüklenir ve ardından 30 dakika sonra SLFS kullanılarak S2'de (dolu daireler) geç LTD indüksiyonu yapılır. S1'de, erken LTP, çapraz etiketleme ve yakalamayı gösteren 6 saat süren geç LTP'ye dönüştürülür (n = 6). Tek ok, erken LTP'yi indüklemek için uygulanan zayıf tetanizasyonu temsil eder. Ok üçlüsü, geç LTP'yi indüklemek için güçlü tetanizasyonu temsil eder. Kırık ok, geç LTD'yi indüklemek için temsili sinaptik girdiye SLFS'nin uygulandığı zaman noktasını temsil eder. Hata çubukları SEM'i gösterir.