Bir Sıçan Hipokampal Diliminde CA3-CA1 Sinaptik Yanıtlarının Kaydedilmesi

Özet

Kaynak: Shetty, M. S. ve diğerleri, Kemirgenlerden Akut Hipokampal Dilimler Kullanılarak Sinaptik Etiketleme/Yakalama ve Çapraz Yakalamanın İncelenmesi.J. Vis. Uzm. (2015).

Bu videoda, bir sıçan hipokampal diliminde CA3-CA1 sinaptik yanıtlarını kaydetme yöntemi gösterilmektedir. Sinaptik yanıt gücünü değerlendirmek için uyarıcı ve kayıt elektrotlarının hipokampal dilim üzerine yerleştirilmesi ve alan uyarıcı postsinaptik potansiyelinin (fEPSP) ölçülmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. CA3-CA1 Sinaptik Yanıtlarının Kaydedilmesi

NOT: Alan potansiyeli kaydı için kullanılan elektrofizyoloji kurulumu Şekil 1A'da gösterilmiştir. Elektrik ayarlarının uygun şekilde topraklanmasından sonra elektriksel parazit kontrolün dışındaysa, bir Faraday kafesi şiddetle tavsiye edilir. Birçok farklı tipte batık ve arayüz odası ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, dilimler içlerinde daha sağlam sinaptik tepkiler sergilediği için arayüz odaları tercih edilir.

1. Elektrotların yerleştirilmesi
   1. Kullanılacak elektrikli cihazı (uyarıcılar ve amplifikatörler) açın. Uyarıcı ve kayıt elektrotlarını mikromanipülatörlerin pleksiglas tutucularına monte edin ve sabitleyin.
      not: Hem uyarucu hem de kayıt amaçlı olarak monopolar, lake kaplı, 5 MΩ dirençli paslanmaz çelik elektrotlar kullanıyoruz.
   2. Kullanmadan önce, bu elektrotları çekilen cam kılcal damarların içine yerleştirin ve elektrot ucunun sadece küçük bir kısmını açığa çıkaracak şekilde epoksi yapıştırıcı ile sabitleyin (Şekil 1E). Bu, aksi takdirde ince olan elektrotlara güç verir ve bunların elektrot tutucularına sıkıca sabitlenmesine yardımcı olur.
   3. Mikroskop altında yönlendirildiğinde, alan-EPSP (fEPSP) yanıtlarını kaydetmek için Schaffer kollateral liflerini ve kayıt elektrodunu CA1'in apikal dendritik bölgesinde uyarmak için uyarıcı elektrotları CA1 bölgesinin stratum radiatumuna yerleştirin.
      not: Elektrotlarla dilimin üzerindeki sıvı yüzeyine yaklaşmak, dilimin yüzeyinin hızlı bir şekilde bulunmasına yardımcı olan bir ses verir (amplifikatörün bir hoparlöre bağlı olması şartıyla).
   4. Sinaptik etiketleme ve yakalama deneylerinde, deneyin ihtiyacına göre, iki veya daha fazla bağımsız ancak örtüşen girişi uyarmak için kayıt elektrodunun her iki tarafına iki veya üç uyarıcı elektrot (S1, S2 veya S3) yerleştirin. Uyarıcı ve kayıt elektrotlarını yaklaşık 200 μm aralıklarla yerleştirin.
   5. Gerekirse, popülasyon artışını kaydetmek için stratum pyramidale katmanında başka bir kayıt elektrodu bulun (Şekil 2A). Her iki elektrot da dilime dokunduğunda, toplama yazılımını kullanarak, uygun bir fEPSP sinyali sağlamak için bir test stimülasyonu verin.
      not: Test stimülasyonu için iki fazlı, sabit akım darbeleri (darbe süresi 0,1 msn/yarım dalga) kullanıyoruz.
   6. Uygun bir fEPSP sinyali elde edildikten sonra, manipülatörlerin ince hareket düğmelerini kullanarak elektrotları yaklaşık 200 μm derinliğe dikkatlice indirin. Dilimlerin iyileşmesi için 20 dakika bekleyin.
2. Giriş-çıkış ilişkisi
   1. Bir dizi akım yoğunluğunda eğim değerini ölçerek her giriş için giriş-çıkış ilişkisini (afferent stimülasyona karşı fEPSP eğimi) belirleyin. Bunu 20 μA ila 100 μA arasında gerçekleştirin. Ardından, maksimum fEPSP eğiminin %40'ını elde etmek için her giriş için stimülasyon yoğunluğunu ayarlayın. Bunu deney boyunca sabit tutun.
   2. 15-20 dakika sonra taban çizgisini kaydetmeye başlayın. Bu süre zarfında fEPSP eğimini yakından izleyin ve eğim ayarlanan değerden %10'dan fazla dalgalanırsa uyaran yoğunluğunu sıfırlayın ve yeni bir referans değer başlatın. Devam etmeden önce en az 30 dakika veya 1 saat kararlı taban çizgisi kaydedin.
      not: Test veya temel stimülasyon için, her 5 dakikada bir verilen 0,2 Hz bifazik, sabit akım darbeleri (polarite başına 0,1 milisaniye) dört tarama kullanıyoruz. Bu dört yanıtın ortalama eğimi daha sonra bir tekrar olarak kabul edilir. Sinyaller bir diferansiyel amplifikatör tarafından filtrelenir ve güçlendirilir, analogdan dijitale dönüştürücü kullanılarak sayısallaştırılır ve özel yapım yazılımla çevrimiçi olarak izlenir.

Sonuçlar

Şekil 1.(A) stimülatörler, (b) bir diferansiyel amplifikatör, (c) bir analogdan dijitale dönüştürücü (d), Osiloskop (e), edinme yazılımına sahip bir bilgisayar, (f) Titreşime dayanıklı masa üstü (g), >4x büyütmeli mikroskop, (h) arayüzlü beyin dilimi odası, (i) ACSF ve karbojen kaynağı için bir perfüzyon sistemi, (j) sıcaklık kontrolörü (k) bir aydınlatma kaynağı (l), elektrot tutu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
I. ACSF bileşen kimyasalları
1. Sodyum klorür (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886 Serisi
2. Potasyum klorür (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541 Serisi
3. Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	M1880
4. Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2.2H2O)	Sigma-Aldrich	C3881 Serisi
5. Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791 Serisi
6. Sodyum bikarbonat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761 Serisi
7. D-Glikoz susuz (C6H12O6)	Sigma-Aldrich	G7021
II. Elektrofizyoloji Aletleri
1. Mikroskop	Olimpos, Japonya	Modeli: SZ61
2. Sıcaklık kontrolörü	Bilimsel Sistemler Tasarım A.Ş. Kanada	PTC03
3. Diferansiyel AC Amplifikatör	Sistemleri, ABD	Tip 1700
4. İzole Nabız Stimülatörü	Sistemleri, ABD	Tip 2100
5. Osiloskop	Rhode & Schwarz	HM0722
6. Dijital-Analog Dönüştürücü	Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, İngiltere	CED-Güç 1401-3
7. Arayüz Beyin Dilimi Odası	Bilimsel Sistemler Tasarım A.Ş. Kanada	BSC01
8. Boru Pompası	Ismatec, Idex Sağlık & Bilim, Almanya	REGLO-Analog
9. Karbojen Akış Ölçer	Cole-Parmer	03220-44
10. Fiber Işık Aydınlatıcı	Dolan-Jenner Endüstrileri	Fiber Lite MI-150
11. Mikromanipülatörler	Marzhauser Wetzlar, Almanya	00-42-101-0000 (MM-33)
		00-42-102-0000 (MM-32)
12. Elektrotlar	Sistemleri, ABD	571000 (Paslanmaz çelik; 0.010, 5MΩ, 8 derece)