Drosophila'da Duyusal Nöronlardan Gelen Fizyolojik Tepkilerin Saptanması

1. Numune Hazırlama

1. Gal4 sürücü hattını UAS-GCaMP5G'ye geçin Drosophila melanogaster sinekleri (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Çaprazın 25 °C.
   'de büyümesine izin verin not: Gal4 veya UAS-GCaMP transgenlerinin birden fazla kopyası ile sinekler üretmek, floresan sinyal yoğunluğunu artırmaya yardımcı olabilir. UAS-GCaMP transgeninin (UAS-GCaMP3) daha önceki bir versiyonu, Gr68a-Gal4 sürücüsünün kontrolü altında ifade edildiğinde çok zayıf floresan yoğunluğu gösterdi.
   1. Yeni kapatılmış yetişkin sinekleri toplayın ve cinsiyete göre ayırın ve 25 ° C'de < br / > yükseltin NOT: GCaMP5G floresansının başlangıç seviyesi, 14 ila 28 günlük sineklerde optimaldir. Sinekleri cinsiyete göre izole etmek, sinirsel tepkileri etkileyebilecek sosyal etkileşimler olasılığını ortadan kaldırır.
2. Hafif bir CO₂ akışı altında bir sineği uyuşturun.
3. Önce 0,17 mm'lik bir lamelin ortasına küçük bir damla oje koyarak sineği bir cam lamel üzerine takın. Şeffaf oje damlasının üzerine nazikçe bir sinek yerleştirin ve sineğin tüm damlayı kapladığından emin olun.
4. 1.5 ve 1.6 adımlarını, 8X büyütmede kullanılan bir diseksiyon stereomikroskobu altında gerçekleştirin.
5. Sineğin ön bacağını uzatmak için ıslak bir boya fırçası kullanın. Birinci ve beşinci tarsal segmentlerin üzerine iki ince şerit bant yerleştirerek ön ayağı yerine sabitleyin (Şekil 1A). Bu, görüntüleme için tarsal segmentler T2-T4'ü ortaya çıkaracaktır (Şekil 1B).
6. Hortum üzerindeki nöronları görüntülemek için, labellumu ortaya çıkarmak için hortumun kürsüsünün üzerine ince bir bant şeridi yerleştirin (Şekil 1C, D).
7. Çözeltinin lamel yüzeyi üzerinden akmasını önlemek için bir PAP (Peroksidaz-antiperoksidaz) kalemiyle sineğin etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Montajdan sonraki 30 dakika içinde ölçün.

2. Uyaran Çözeltisinin Hazırlanması

1. Bir PBST (Triton X-100 ile Fosfat Tamponlu Salin) çözeltisinde lipofilik ligandları (bu çalışmada kullanılan CH₅0₃ gibi) seyreltin: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄,% 0.1 Triton X-100 (h / h); pH 7.4.
   1. PBST kullanarak ligandın 1 mg / ml'lik bir stok çözeltisini yapın. Stok çözeltisinin sonraki tüm seyreltmelerini PBST.
      kullanarak hazırlayın not: İlgilenilen ligandın çözünürlüğüne bağlı olarak, onu çözmek için farklı çözücülere ihtiyaç duyulabilir. Tablo 1, CH₅0_3'ün çeşitli çözücüler içindeki çözünürlüğünü açıklamaktadır. Diğer çözücülerin aksine, PBST floresansı arttırmadı.

3. Tat Nöronlarının Uyarılması ve Görüntü Elde Edilmesi

1. 10 μl'lik bir pipetleyici kullanarak, tarsal segmentlere 10 μl PBST yerleştirin.
   not: Bu adım bacağı nemlendirir ve tarsal segmentlerin kaymasını önler.
2. Yüksek zaman çözünürlüğünde iyi bir floresan sinyali elde etmek için yeterli hız ve hassasiyete sahip bir kameraya sahip bir optik sistem kullanın.
   not: Bu çalışma için bir eğirme diski konfokal mikroskop ve bir sCMOS kamera kullandık (Malzeme Listesine bakınız).
3. Görüntülenecek spesifik tarsal segmenti ve nöronları seçin. Üç ön stimülasyon konfokal Z-yığını elde edin.
   1. İdeal olarak, tüm hücre hacmini yakalamaya devam ederken maksimum zaman çözünürlüğüne izin verecek kadar hızlı olan alım ayarlarını kullanın. Örnek çekim ayarları şunlardır: 200 msn pozlama, 2 x 2 ve 6 x 0,5 μm2 optik kesitleri gruplama, her 2 saniyede bir yakalanır.
      NOT: Hareketsiz bacaklar, GCaMP sinyalinde fark edilebilir bir ağartma olmadan, 30 saniyelik aralıklarla 10 dakikaya kadar başarılı bir şekilde görüntülenmiştir. Daha uzun kayıt süreleri için, bacakların lamel üzerinde çok sıkı bir şekilde yerinde tutulduğundan emin olun.
   2. Tüm görüntüleme rejimi boyunca minimum foto ağartma ile elde edilebilecek en yüksek sinyal-gürültü için lazer gücünü optimize edin. Burada açıklanan deneyler için, bacaklardaki ve hortumdaki Gr68a ve ppk23 tat nöronlarını görüntülemek için% 30 iletimde 491 nm diyot lazer (100 mW) kullanın. Yeterli uzamsal çözünürlük elde ederken daha kısa pozlama sürelerine izin vermek için 2 x 2 gruplama kullanın.
      not: Lazer gücü ayarları, 1,2 ila 4,5 kat arasında değişen floresan değişikliklerini algılamak için optimize edildi.
4. Uyarıcı çözeltinin 10 μl'sini tarsal segmentlere pipetleyin. Kontrol deneyleri için 10 μl daha PBST ekleyin. Hemen 117 stimülasyon sonrası görüntü elde edin.
   not: Elde edilen stimülasyon sonrası görüntülerin sayısı, floresanstaki maksimum değişime ulaşmak için geçen süreye (yaklaşık 2 dakika) dayanmaktadır.
   1. KRİTİK ADIM: Preparat üzerinde çözelti pipetlerken, ön bacağın yerinden çıkmasına neden olacağından pipet ucuyla sineğe dokunmayın.
      not: Alternatif olarak, görüntülenecek tarsal segmente yakın uyaran içeren bir cam kılcal damarı doğru bir şekilde konumlandırmak için bir mikromanipülatör kullanın. Üreticinin talimatlarına göre hücre içi bir mikroenjeksiyon dağıtıcısı kullanarak kontrollü hacimlerde uyaran verin.

Resim 1: Ön bacak veya hortum nöronlarının görüntülenmesi için canlı bir sineğin montajı. (A) Ön bacağın montajı: Canlı bir erkek sineğin 3.2X görüntüsü, ön ayakların lamel bantla tutturulduğunu gösterir. (B) Sineğin 40X görüntüsü, tarsal segmentlerin her birini (T1-5) ve bandın birinci tarsal segmentin üzerine ve beşinci tarsal segmente yerleştirilmesini gösterir. (C) Hortumun montajı: Hortumun ucunu ortaya çıkarmak için kürsünün üzerine bir parça bant yerleştirilir. (D) Uyaran ilavesi için pipet ucu, sineğin biraz üzerinde tutulur ve preparat ile doğrudan temas etmez.

Tablo 1: CH503'ün çeşitli çözücülerde çözünürlüğü. DMSO: Dimetil sülfoksit. Etanol, hekzan ve DMSO çözeltileri dH2O (h/h) ile seyreltildi. CH503'ün% 0.2 DMSO'daki çözünürlüğü sadece 250 ng / ml ile sınırlıydı. Tek başına çözücü ile ΔF / F'deki artış, feromon ile stimülasyon üzerine gözlenene eşdeğerdi.