Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

Özet

Kaynak: Kinnavane, L., et al. Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Ex Vivo Optogenetik Sorgulaması. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, medial prefrontal korteks (mPFC) aksonlarını optogenetik olarak uyararak ve LEC'deki piramidal nöronların yanıtlarını kaydederek lateral entorinal kortekste (LEC) sinaptik verimliliği inceleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyon ile birleştirir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Elektrofizyoloji ve optogenetik stimülasyon

1. Hedef hücrenin tanımlanması.
   1. Dilimi, peristaltik bir pompa ile 2 mL/dk hızında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile perfüze edilmiş 34 °C'de batık bir kayıt odasına yerleştirin. Bir dilim ankrajı kullanarak dilimi hareketsiz hale getirin.
   2. Eğik kızılötesi aydınlatma kullanan bir geniş alan mikroskobunun düşük büyütme (4x) hedefi altında, lateral entorinal korteks (LEC) katman 5'e gidin. Piyal yüzeyden gerekli katmana olan mesafeyi ölçün.
      not: Eğik kızılötesi aydınlatma, kayıt odası lamel altının yaklaşık 3 mm altına, lamel düzlemine ~55°'lik bir açıyla yakın kızıl ötesi bir LED yerleştirilerek elde edildi (Şekil 1B). Diferansiyel girişim kontrastı, kesit elektrofizyolojisi için alternatif ve yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir.
   3. Yüksek büyütmeli suya daldırma hedefine (40x) geçin ve piramidal nöronları tanımlayın. Hücrenin bilgisayar monitöründeki konumunu bantla işaretleyin.
      not: Piramidal nöronlar, dilimin pial yüzeyine doğru çıkıntı yapan belirgin apikal dendritler ile kabaca üçgen bir morfolojiye sahiptir (Şekil 2A). Hücre sağlığı, yoğunlaştırılmış, görünür bir çekirdeğin olmaması ve pürüzsüz görünmesi gereken plazma zarının incelenmesi ile değerlendirilebilir. Geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanıldığında, opsin-florofor füzyon proteini tarafından aksonların net floresan etiketlemesinin görünür olması olası değildir. Aksonal projeksiyonları görselleştirmek için, opsin'in floroforuna karşı bir birincil antikor kullanarak post-hoc immünohistokimya gerçekleştirin ve aynı veya benzer dalga boyuna sahip bir florofora konjuge edilmiş ikincil bir antikor ile amplifiye edin.
2. Tüm hücre yama kelepçesinin oluşumu.​
   1. Bir pipet çektirme kullanarak bir borosilikat cam mikropipet imal edin ve filtrelenmiş hücre içi kayıt solüsyonu (120 mM k-glukonat, 40 mM HEPES (N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit), 10 mM KCl (potasyum klorür), 2 mM NaCl (sodyum klorür), 2 mM MgATP (magnezyum adenosin trifosfat), 1 mM MgCl (magnezyum klorür), 0.3 mM NaGTP (sodyum guanozin trifosfat), 0.2 mM EGTA (Etilen glikol tetraasetik asit), ve UPW'de (ultra saf su), pH 7.25, 285-300 mOsm'de yapılan% 0.25 biyositin). Doldurulmuş mikropipeti, elektrot telinin hücre içi çözelti ile temas halinde olduğundan emin olarak, yama kelepçesi amplifikatör kafasındaki elektrot tutucusuna yerleştirin.
   2. Hortumla elektrot tutucu yan bağlantı noktasına bağlanan bir ağızlığa (piston çıkarılmış 1 mL'lik bir şırınga gibi) sertçe üfleyerek ağızdan pozitif basınç uygulayın ve sıralı üç bir vanayı kapatarak basıncı koruyun. Mikroskop objektifini bir menisküs oluşacak şekilde kaldırın ve elektrodu mikroskopta görülene kadar menisküsün içine yerleştirin.
   3. WinLTP16'da (veya başka bir edinme yazılımında/osiloskopunda) Sızdırmazlık Testi penceresini açın ve amplifikatör voltaj-clamp modundayken, pipet direncinin 5-3 MΩ olup olmadığını belirlemek için 6 mV'luk bir kare darbe uygulayın.
   4. Tanımlanan hücreye pipet ucuyla yaklaşın ve dokunun; bu, hücre zarında bir girinti (Şekil 2A; sağ panel) ve pipet direncinde küçük bir artış (0.1 MΩ) ile sonuçlanmalıdır.
   5. Pozitif basıncı serbest bırakın ve ağızlıkta orta derecede emme uygulayarak negatif basınç uygulayın; bu, pipet direncinde (>1000 MΩ) büyük bir artışa neden olmalıdır. Basınç artık nötr bırakılabilir. Hücre zarı yırtılana kadar kademeli olarak artan bir rampada negatif basınç uygulayın ve tüm hücre kapasitansı geçici akımlarına neden olun.
3. Optogenetik olarak uyarılmış sinaptik olayları kaydedin.
   1. Akım kelepçesi yapılandırmasını girin.
      NOT: Çoğu durumda, uzun menzilli sinaptik iletim glutamaterjiktir, bu nedenle klorür tersine çevirme potansiyeline yakın membran potansiyellerinde kayıt, AMPA reseptörü (AMPAR) aracılı iletimi en iyi şekilde izole edecek ve uyarılan herhangi bir ileri besleme inhibisyonunun (FFI) ölçümünü en aza indirecektir. Klorür tersine çevrilmesi, hücre içi kayıt çözeltisi ve aCSF'nin bileşimine bağlıdır ve Goldman-Hodgkin-Katz denklemi kullanılarak hesaplanabilir; yukarıdaki çözümler için bu -61.3 mV idi. Katman 5 LEC piramidal nöronların ortalama dinlenme membran potansiyeli -62 mV'dir ve gerektiğinde sabit akım enjeksiyonu ile bu potansiyelde tutulmuştur. Alternatif olarak, hücreler istenen potansiyele voltaj ile kenetlenebilir. Uzun menzilli inhibitör projeksiyonları kaydetmek için16 veya GABAerjik klorür iletkenliğini izole etmek için katyon tersine çevirme potansiyelinde FFI, voltaj kelepçesi kaydetmek. Aksiyon potansiyeli eşiğinin üzerindeki membran potansiyellerinde voltaj kenetleyen nöronlar olduğunda, voltaj kıskacını iyileştirmek ve aksiyon potansiyellerinin başlamasını önlemek için voltaj kapılı sodyum kanal blokerleri içeren sezyum bazlı bir hücre içi çözelti kullanılır (130 mM CsMeSO4 (sezyum metansülfonat), 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 klorür, 4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, UPW'de yapılan %0.25 biyositin, pH 7.25, 285-300 mOsm).
   2. Veri toplama yazılımını kullanarak, monte edilmiş 470 nm LED'i etkinleştirmek için transistör-transistör mantık (TTL) sinyallerini bir LED (ışık yayan diyot) sürücüsüne gönderin. Monte edilen LED, optogenetik uyarıcı post-sinaptik potansiyelleri (oEPSP'ler) uyandırmak için 1x objektif aracılığıyla dilime ışık darbeleri uygulamak için filtre küpleri ve uygun optikler (Şekil 40B) kullanılarak mikroskop ışık yoluna yönlendirilir.
      not: Işık darbeleri perisomatik olarak / dendritlerin üzerine uygulanabilir, bu da aksonlarda ve presinaptik boutonda opsinlerin aktivasyonuna neden olur veya araştırmacı, aşırı bouton stimülasyonunu önlemek için hedefi kaydedilen hücreden aksonlara hareket ettirebilir. Maksimum oEPSP amplitüdü, sinaptik projeksiyonun gücüne, viral enjeksiyonların etkinliğine ve kullanılan opsine bağlıdır. oEPSP'ler, değişen ışık yoğunluğu ve/veya süresi ile istenen genliğe titre edilebilir18; ışık darbelerinin süresinin değiştirilmesi (maksimum LED güç çıkışında 0,2-5 ms arasındaki tipik süre, bu da 4,4 mW/mm ışık yoğunluğu ile sonuçlanır19), LED'in güç çıkışını değiştirmekten daha tutarlı oEPSP genlikleri verir.
   3. Farklı uyaranlar arası aralıklara sahip çoklu ışık darbelerinin trenlerini ileterek presinaptik salınım özelliklerini (voltajdaki değişiklik) araştırın (Şekil 2E); optogenetik olarak uyarılmış iletimi yorumlarken dikkatli olunmalıdır.
   4. Tekrar tekrar oEPSPs19'u uyandırarak veya ligandların uygulanmasıyla uzun süreli plastisiteyi araştırın. Plastisite indüksiyonundan önce stabiliteyi sağlamak için oEPSP genliğini 5-10 dakika izleyin ve ardından kararlı bir genliğe ulaşılana kadar (tipik olarak 30-40 dakika) izleyin.
      not: Mevcut opsinlerin çoğu, tipik olarak LTP'yi indüklemek için kullanıldığı gibi, yüksek frekanslarda, örneğin 100 Hz'de verilen 100 uyaran gibi çoklu aksiyon potansiyellerini güvenilir bir şekilde uyandırma yeteneğine sahip değildir.
   5. oEPSP'lerin monosinaptik olduğunu doğrulamak için, hedefi dendritik çardak üzerine konumlandırarak ve 0.5 μM tetrodotoksin ve 100 μM aminopiridin varlığında uyararak transdüksiyonlu yolun aşırı bouton aktivasyonunu gerçekleştirin. Tetrodotoksin uygulaması, yanıtlar aksiyon potansiyeline bağlıysa iletimi ortadan kaldıracaktır ve daha sonra aminopiridin dahil edilmesi, oEPSP'ler monosinaptik olarak üretilirse iletimi kısmen geri yükleyecektir19,20.
   6. Biyositinin nöronu doldurmasına izin vermek için, tüm hücre konfigürasyonuna girdikten sonra en az 15 dakika bekleyin. Voltaj kelepçesinde, membran kapasitansını ve giriş direncini izleyin.
   7. Pipeti yaklaşma açısı boyunca hücrenin somasından yavaşça çekin, kapasitans geçici akımlarının ve zar akımının yavaş yavaş kaybolduğunu gözlemleyin, bu da hücre zarının yeniden sızdırmazlığını ve pipet ucunda dıştan dışa bir yama oluştuğunu gösterir. Dilimin yönlendirmesine ve dilim içindeki hücrelerin konumuna dikkat edin. Dilimi 24 oyuklu bir plakada PFA'ya (paraformaldehit) koyun, gece boyunca 4 °C'de inkübe edin ve ardından 0,1 M PB'ye aktarın.
      not: Dilimler bir haftaya kadar saklanabilir. Daha uzun depolama gerekiyorsa, PB'yi (fosfat tamponu) düzenli olarak değiştirin veya sodyum azit içeren PB kullanın (% 0.02 -% 0.2 sodyum azid).

Sonuçlar

Şekil 1: Görselleştirilmiş tüm hücre kayıtları, optogenetik uyarılma ve tdTomato-pozitif nöronların tanımlanması için dilim toplama odası ve optik konfigürasyon. (A) Dilim toplama odası14, bir naylon ağ tabakasına yapıştırılmış bir mikrosantrifüj tüp rafından özel olarak yapılmıştır ve içine aCSF'ye daldırıldığı bir behere yerleştirilir (B) ChR2 (channelrhodopsin-2) (...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3 luer vana	Cole-Parmer	WZ-30600-02
40x objektif	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopiridin	Merhaba Biyografi	HB1073
4x objektif	Olympus	PLN4X/0.1
Akromatik mercek	Edmund Optik	49363	Görsel spektrumu ve yakın IR'yi odaklar
Tezgah üstü mikrosantrifüj	Kıyaslama Bilimsel	C1005*
Biyosit	Sigma-Aldrich	B4261
Borozillik cam kılcal damar	Warner Enstrümanları	G150F-6
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670 Serisi
Kamera - Qimaging Retiga Elektro	Fotometri	01-ELEKTRO-M-14-C
Karbakol	Tocris (Türkçe)	2810
Klorheksidin cerrahi önlük	Vetasept	XHG008
Makas	Andis Antik Kenti	22445	AGC Super 2 Hızlı Ayrılabilir Bıçak Kesme Makinesi
Kolimasyon kondansatör lensi	Thor Laboratuvarları	ACL2520-A
Lameller	Balıkçı Bilimsel Ltd	10011913
Kriyostat	Leica Belediyesi	CM3050 S Serisi
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Siyanoakrilat yapıştırıcı	Hızlı Elektronik Ltd	84-4557
Veri toplama cihazı	Ulusal Enstrümanlar	USB-6341 BNC
D-glikoz	Sigma-Aldrich	G8270
Dikroik ayna 500 nm uzun geçiren	Edmund Optik	69899
Dikroik ayna 600 nm uzun geçiren	Edmund Optik	69901
Dikroik ayna küpü	Thor Laboratuvarları	CM1-DCH/M
EGTA (EGTA)	Değirmen gözeneği	324626
Yan portlu elektrot tutucu	HEKA (Türkçe	895150
Emisyon filtresi	Chroma	59022 milyon
Uyarma filtresi	Chroma	ET570/20x
Göz jeli	Kır	Yağlar
İnce boya fırçası	Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri	BRU2052
giyotin	Dünya Hassas Aletler	DCAP (Demokratik Tarım T
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma-Aldrich	H3375
Hidrojen peroksit çözeltisi	Sigma-Aldrich	H1009	%30 (a/a)
İzofluran	Henry Schein	988-3245
İzopentan	Sigma-Aldrich	M32631 Serisi
Kartal	Sigma-Aldrich	P3911 Serisi
K-glukonat	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematik floresan filtre küpü	Thor Laboratuvarları	DFM1T1
LED sürücü	Thor Laboratuvarları	LEDD1B
MgATP (MgATP)	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Mikroelektrot çektirme	Sutter çalgıları	P-87
Mikroenjeksiyon şırınga	Hamilton	7634-01/00
Mikroenjeksiyon şırınga iğnesi	Hamilton	7803-05	Özel özellikler: ölçü 33, uzunluk 15mm, nokta stili 4 - 12 °
Mikroenjeksiyon şırınga pompası	Dünya Hassas Aletler	UMP3T-1
Monte edilmiş mavi LED	Thor Laboratuvarları	M470L5
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390 Serisi
NaCl (Doğal)	Sigma-Aldrich	S9888 Serisi
NaGTP (NaGTP)	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751 Serisi
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638 Serisi
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761 Serisi
NIR YOL ÜRETİMİ	İSGİM DEVLETLERİ	SFH4550	Dilimin kırılmalı IR görüntülemesi için kullanılan diferansiyel girişim kontrastı (DIC) optikleri, yaygın olarak kullanılan başka bir yöntemdir
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148 Serisi
Yama kelepçesi amplifikatörü	Moleküler Cihazlar	700bir
Peristaltik pompa	Dünya Hassas Aletler	Mini Yıldız
Poli-L-lizin kaplı mikroskop slaytları	Balıkçı Bilimsel Ltd	23-769-310
Kayıt odası	Warner Enstrümanları	RC-26G (RC-26G)
Dilim çapası	Warner Enstrümanları	SHD-26-GH/15
Mikro matkap için stereotaksik tutucu	Harvard Aygıtı	75-1874
Sakaroz	Sigma-Aldrich	S0389 Serisi
Cerrahi Mikroskop	Carl Zeiss	OPMI 1 FR yanlısı
Hücre içi kayıt çözümü için şırınga filtresi	Termo Bilimsel Nalgene	171-0020
Dik floresan mikroskobu	Leica Belediyesi	DM6 B
çözüm
aCSF (İş Deposu)
Sükroz Kesme Çözeltisi
PFA (Üstün Başarı T