Drosophila Larva Sinir Hücrelerinde Mikroelektrot Aracılı FM Boya Yükleme ve Boşaltma

Özet

Kaynak: Kopke, D. L., et al., Sinapsta FM boya döngüsü: yüksek potasyum depolarizasyonu, elektriksel ve channelrhodopsin stimülasyonunun karşılaştırılması. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, Drosophila larvaları sinir lifleri, hücre zarı lipidlerine bağlanan FM boyasına daldırılır. Emme mikroelektrodu ve elektrik darbeleri, FM boyasını yeni oluşan endositik veziküllere dahil ederek endositoz sürecini uyarır. Nörotransmisyonun presinaptik aşamalarını görselleştiren bu yöntem, sinaptik fonksiyonu ve nörotransmitter salınımını incelemek için yararlıdır.

Protokol

1. Larva Tutkal Diseksiyonu

1. 10 parça silikon elastomer tabanı, elastomer kitinden 1 parça silikon elastomer kürleme maddesi ile iyice karıştırın.
2. 22 x 22 mm cam lamelleri elastomer ile kaplayın ve sıcak bir plaka üzerinde 75 °C'de birkaç saat kürleyin (artık dokunulduğunda yapışkan olmayana kadar).
3. Larva diseksiyonu için özel yapım pleksi cam diseksiyon haznesine tek bir elastomer kaplı cam lamel yerleştirin.
4. İstenen konik ve uç boyutunu elde etmek için standart bir mikroelektrot çektirmesi kullanarak tutkal pipetlerini borosilikat cam kılcal damardan hazırlayın.
5. Mikropipet ucunu yavaşça kırın ve diğer ucuna 2 ft esnek plastik tüp (1/32" iç çap, ID; 3/32" dış çap, OD; 1/32" duvar; ağızla uyumlu (P2 pipet ucu) takın.
6. Larva diseksiyonuna hazırlanırken, küçük bir kabı (0.6 mL Eppendorf tüp kapağı) küçük bir hacim (~ 20 μL) yapıştırıcı ile doldurun.
7. Hazneyi tuzlu su ile doldurun (mM cinsinden): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sükroz ve 5 2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES) pH 7.2.
8. Diseksiyon sırasında NMJ presinaptik terminali etiketlemek için Alexa Fluor 647'ye (anti-HRP: 647; 1 mg / mL stoktan 1:10 seyreltin) konjuge anti-at turpu peroksidaz (HRP) antikoru ekleyin21,22.
9. İnce bir boya fırçası (2 numara) kullanarak, yiyecek şişesinden dolaşan üçüncü bir instarı çıkarın ve elastomer kaplı kapak camına yerleştirin.
10. Cam mikropipet ucunu, ataşman ile ağız tarafından üretilen negatif hava basıncını kullanarak küçük bir hacimde yapıştırıcı ile doldurun (adım 1.5).
11. Larva sırt tarafını forseps ile yukarı yerleştirin ve ağızdan pozitif hava basıncı kullanarak küçük bir damla yapıştırıcı ile kafayı elastomer kaplı lamel üzerine yapıştırın.
12. Bu prosedürü larvanın arka ucu ile tekrarlayın ve hayvanın iki tutkal eki arasında gergin bir şekilde gerildiğinden emin olun.
13. Makas (bıçaklar 3 mm) kullanarak, arkada yatay bir kesim (~ 1 mm) ve sırt orta hattı boyunca dikey bir kesim yapın.
14. İnce forseps (# 5) kullanarak, dorsal trakea, bağırsak, yağ gövdesi ve kas sistemini kaplayan diğer iç organları nazikçe çıkarın.
15. Dört gövde duvarı kanadı için yapıştırma prosedürünü tekrarlayın; gövde duvarını yatay ve dikey olarak nazikçe gerin.
16. Forseps kullanarak ventral sinir kordonunu (VNC) kaldırın, motor sinirleri makasla dikkatlice kesin ve ardından VNC'yi tamamen çıkarın.
17. SV döngüsünü durdurmak için, diseksiyon salinini Ca²⁺ içermeyen salin ile değiştirin (CaCl₂ içermeyen yukarıdaki diseksiyon saliniyle aynı).

2. Elektriksel Stimülasyon FM Boya Yükleme

1. Gerekli konik ve uç boyutunu elde etmek için mikroelektrot çekiciyi kullanarak bir emme pipeti hazırlayın.
2. Mikroelektrot ucunu, tek bir motor siniri sıkı bir şekilde emilebilecek duruma gelene kadar bir mikro dövme ile ateşle parlatın.
3. Emme pipetini bir mikromanipülatör üzerindeki elektrot tutucusuna kaydırın ve uzun esnek plastik tüpe ve bir şırıngaya takın.
4. Stimülatör parametrelerini ayarlayın (örneğin, 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süre ve 5 dakika veya 1 dakikalık süre.
5. Larva preparatındaki Ca²⁺ içermeyen salini, elektrofizyoloji teçhizatındaki yukarıdaki FM1-43 salin (4 μM; 1 mM CaCl₂) ile değiştirin.
6. Preparasyonu mikroskop aşamasına koyun ve larva ve emme pipeti odaklanana kadar sahneyi kaldırın (40X suya daldırma objektifi).
7. Şırınga tarafından üretilen negatif hava basıncı ile seçilen yarım segmenti emme elektroduna innerve eden bir kesme motor siniri halkasını emdirin.
8. Seçilen hemisesegmentte kas kasılmasını görsel olarak izlerken kısa bir stimülasyon patlaması ile emme elektrot işlevini test edin.
9. SV endositozu ve FM1-43 boya alımını sağlamak için seçilen parametreleri (adım 2.4) kullanarak motor siniri uyarın.
10. ^FM2-5 boya solüsyonunu tamamen çıkarmak için Ca 1+ içermeyen tuzlu su ile (1 dakika boyunca 43x) hızlı bir şekilde yıkayın.
11. Yukarıdan konfokal görüntüleme protokolünü kullanarak anında görüntüleme için larva preparatını taze Ca²⁺ içermeyen salin içinde tutun.
12. FM boya boşaltma işleminden sonra aynı NMJ'ye erişim sağlamak için NMJ görüntüsünü (segment, yan ve kas) dikkatlice not edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SylGard 184 Silikon Elastomer Kiti	Balıkçı Bilimsel	NC9644388	Diseksiyonlar için kapak camı koymak için
Mikroskop Kapak Camı 22x22-1	Balıkçı markası	12-542-B	Diseksiyonlar için SylGard'ı koymak için
Alüminyum Üst Sıcak Plaka Tipi 2200	Termolin	HPA2235M	SylGard'ı iyileştirmek için
Pleksi cam diseksiyon odası	Yok	Yok	El yapımı
Borosilikat Cam Kılcal Damarlar	TEFE	1B100F-4	Emme ve tutkal mikropipetleri yapmak için
Lazer Tabanlı Mikropipet Çektirme	Sutter Enstrümanı	P-2000	Emme ve tutkal mikropipetleri yapmak için
Tygon E-3603 Laboratuvar Hortumu	Bileşen Tedarik A.Ş.	TET-031A	Ağız ve emme pipeti için
P2 pipet ucu	ABD Bilimsel	1111-3700	Ağız pipeti için
0,6 mL Eppendorf tüp kapağı	Balıkçı Bilimsel	05-408-120	Diseksiyon için yapıştırıcı koymak için kullanılır
Vetbond 3M Ürün Mağazası	TEFE	Veteriner Tahvili	Diseksiyonlar için kullanılan yapıştırıcı
Potasyum Klorür	Balıkçı Bilimsel	P-217	Forsaline
Sodyum Klorür	Kırlangıç Sigma	S5886 Serisi	Tuzlu su için
Magnezyum Klorür	Balıkçı Bilimsel	M35-500	Tuzlu su için
Kalsiyum Klorür Dihidrat	Kırlangıç Sigma	C7902	Tuzlu su için
Sakaroz	Balıkçı Bilimsel	S5-3 Serisi	Tuzlu su için
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Kırlangıç Sigma	H3375	Tuzlu su için
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson İmmün Araştırma	123-605-021	Nöronal zarları etiketlemek için
Paintbrush	Winsor ve Newton	94376864793	Larvaları manipüle etmek için
Dumont Dumostar Cımbız #5	TEFE	500233	Diseksiyon sırasında kullanılır
7 cm McPherson-Vannas Mikromakas (bıçaklar 3 mm)	TEFE	14177	Diseksiyon sırasında kullanılır
FM1-43	Balıkçı Bilimsel	T35356	Floresan stiril boya
Dijital Zamanlayıcı	VWR (VWR)	62344-641	FM boya yükleme/boşaltma zamanlaması için
Mikro Dövme	TEFE	MF200	Cam mikropipetleri ateşle parlatmak için
20 mL Şırınga Kayma Ucu	Bd	301625	Elektriksel stimülasyon için aksonu emmek için.
Mikro Manipülatör (manyetik taban)	Narishige (Narishig)	MMN-9	Elektriksel stimülasyon için emme elektrodunu kontrol etmek için
Uyarıcı	çimen	S48 Serisi	LED'i ve elektrik stimülasyonunu kontrol etmek için
Zeiss Aksiyoskop Mikroskobu	Zeiss		Elektriksel stimülasyon sırasında kullanılır.
40X Achroplan Suya Daldırma Hedefi	Zeiss		Elektriksel stimülasyon ve konfokal görüntüleme sırasında kullanılır
Kamera portlu Zeiss Stemi Mikroskop	Zeiss	2000-C	Lovardopsin stimülasyonu sırasında kullanılır
T-Cube LED Sürücü	Thor Laboratuvarları	LEDD1B	LED'i kontrol etmek için
LED Güç Kaynağı	Cincon Elektronik A.Ş.	TR15RA150	LED'e güç sağlamak için
Optik Güç ve Enerji Ölçer	Thor Laboratuvarları	PM100D	LED yoğunluğunu ölçmek için