Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

Özet

Kaynak: Kopke, DL, et al., FM Sinapsta Boya Döngüsü: Yüksek Potasyum Depolarizasyonu, Elektrik ve Channelrhodopsin Stimülasyonunun Karşılaştırılması. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, bir floresan boya kullanarak channelrhodopsin eksprese eden Drosophila larvalarındaki nöromüsküler kavşaklarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için bir protokolü göstermektedir. Mavi ışık, channelrhodopsinleri aktive ederek kalsiyum akışına ve sinaptik vezikül ekzositozuna neden olur. Boya, nöronal membranlara entegre olur ve endositoz sırasında içselleştirilir, bu da floresanın artmasına neden olur. Daha fazla mavi ışık stimülasyonu, azaltılmış floresan ile gösterilen ekzositoz ve boya salınımına neden olur.

Protokol

>1. Larva Tutkal Diseksiyonu

1. 10 kısım silikon elastomer tabanı, elastomer kitinden (Malzeme Tablosu) 1 kısım silikon elastomer kürleme maddesi ile iyice karıştırın.
2. 22 x 22 mm cam lamelleri elastomer ile kaplayın ve sıcak bir plaka üzerinde 75 °C'de birkaç saat kürleyin (artık dokunulduğunda yapışkan olmayana kadar).
3. Larva diseksiyonuna hazırlık olarak özel yapım pleksiglas diseksiyon odasına (Şekil 1, alt) tek bir elastomer kaplı cam lamel yerleştirin.
4. İstenen konik ve uç boyutunu elde etmek için standart bir mikroelektrot çektirmesi kullanarak tutkal pipetlerini borosilikat cam kılcal damardan hazırlayın.
5. Mikropipet ucunu nazikçe kırın ve diğer ucuna 2 ft esnek plastik tüp (1/32" iç çap, ID; 3/32" dış çap, OD; 1/32" duvar; Malzeme Tablosu) ağza oturan (P2 pipet ucu).
6. Larva diseksiyonuna hazırlık olarak küçük bir kabı (0.6 mL Eppendorf tüp kapağı) küçük hacimli (~ 20 μL) tutkalla (Malzeme Tablosu) doldurun.
7. Hazneyi tuzlu su ile doldurun (mM cinsinden): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sükroz ve 5 2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES) pH 7.2.
8. Diseksiyon sırasında nöromüsküler kavşak (NMJ) presinaptik terminalini etiketlemek için Alexa Fluor 647'ye (anti-HRP: 647; 1 mg / mL stoktan 1:10 seyreltin) konjuge edilmiş anti-at turp peroksidaz (HRP) antikoru ekleyin.
9. İnce bir boya fırçası (2 numara) kullanarak, dolaşan üçüncü bir instar larvasını gıda şişesinden çıkarın ve elastomer kaplı kapak camına yerleştirin.
10. Cam mikropipet ucunu, bağlantı ile ağız tarafından oluşturulan negatif hava basıncını kullanarak küçük bir hacimde yapıştırıcı ile doldurun (adım 1.5).
11. Larva sırt tarafı yukarı bakacak şekilde forseps ile konumlandırın ve ağızdan pozitif hava basıncı kullanarak kafayı küçük bir damla yapıştırıcı ile elastomer kaplı lamel üzerine yapıştırın.
12. Bu işlemi larvanın arka ucu ile tekrarlayın ve hayvanın iki tutkal eki arasında gergin bir şekilde gerildiğinden emin olun.
13. Makas kullanarak (bıçaklar 3 mm; Malzeme Tablosu), posteriorda yatay bir kesim (~ 1 mm) ve dorsal orta hat boyunca dikey bir kesim yapın.
14. İnce forseps (# 5, Malzeme Tablosu) kullanarak, dorsal trakea, bağırsak, yağ gövdesi ve kas sistemini kaplayan diğer iç organları nazikçe çıkarın.
15. Gövde duvarını hem yatay hem de dikey olarak nazikçe gerdiğinizden emin olarak dört gövde duvarı kanadı için yapıştırma prosedürünü tekrarlayın.
16. Forseps kullanarak ventral sinir kordonunu (VNC) kaldırın, motor sinirleri makasla dikkatlice kesin ve ardından VNC'yi tamamen çıkarın.
17. Sinaptik vezikül (SV) döngüsünü durdurmak için diseksiyon salinini Ca²⁺ içermeyen salin ile (CaCl₂ içermeyen yukarıdaki diseksiyon saliniyle aynı) değiştirin.

2. Görüntüleme: Konfokal Mikroskopi

1. NMJ boya floresansını görüntülemek için 40X suya daldırma objektifine sahip dik bir konfokal mikroskop kullanın (diğer mikroskoplar kullanılabilir).
2. Karın segmentleri 2-4'ün 4 NMJ'sini görüntüleyin (diğer NMJ'ler görüntülenebilir) ve uygun yazılımı kullanarak görüntüleri toplayın (Malzeme Tablosu).
3. HRP:647'yi uyarmak için bir HeNe 633 nm lazer (635 nm > uzun geçiren filtre ile) ve FM1-43'ü uyarmak için bir Argon 488 nm lazer (530-600 nm bant geçiren filtre ile) kullanın.
4. Her iki kanal için optimum kazancı ve ofseti operasyonel olarak belirleyin.
   not: Bu ayarlar, deneyin geri kalanı boyunca sabit kalacaktır.
5. Sinaptik terminalin HRP işaretli üstünden aşağıya doğru seçilen tüm NMJ boyunca konfokal bir Z-yığını alın.
6. FM boya boşaltma işleminden sonra tam olarak aynı NMJ'ye fazlalık olduğundan emin olmak için görüntülenen NMJ'yi (segment, yan ve kas) dikkatlice not edin.

3. Channelrhodopsin Stimülasyonu FM Boya Yükleme

1. ChR2 ko-faktör all-trans retinal (etanol içinde çözülmüş; 100 μM nihai konsantrasyon) içeren gıdalarda ChR2 eksprese eden larvaları yükseltin.
2. Larva preparatını, bir kamera portu ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu tablası üzerindeki pleksiglas hazneye yerleştirin.
3. Mavi bir LED (470 nm; Malzeme Tablosu) bir koaksiyel kablo kullanarak programlanabilir bir stimülatöre bağlayın ve LED'i kamera bağlantı noktasına yerleştirin.
4. Mikroskop yakınlaştırma işlevini kullanarak mavi LED ışık huzmesini disseke edilmiş larva işlevine odaklayın.
5. Larva preparatındaki Ca^{2 +} içermeyen salini, optogenetik aşamada yukarıdaki FM1-43 salin (4 μM; 1 mM CaCl₂) ile değiştirin.
6. Stimülatörü kullanarak LED parametrelerini ayarlayın (örn. 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süre ve 5 dakikalık süre (Şekil 2)).
7. Işık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca bir zamanlayıcı ile takip edin (örn., 5 dakika; Şekil 2).
8. Zamanlayıcı durduğunda, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için Ca²⁺ içermeyen tuzlu su ile değiştirin.
9. FM boya solüsyonunun tamamen çıkarıldığından emin olmak için Ca²⁺ içermeyen tuzlu su ile (1 dakika boyunca 5x) hızlı bir şekilde arka arkaya yıkayın.
10. Görüntüleme protokolünü kullanarak konfokal mikroskop ile anında görüntüleme için larva preparatını taze Ca²⁺ içermeyen tuzlu suda tutun.
11. FM boya boşaltma işleminden sonra tam olarak aynı NMJ'ye erişim sağlamak için görüntülenen NMJ'yi (segment, yan ve kas) dikkatlice not edin.

4. Channelrhodopsin Stimülasyonu: FM Boya Boşaltma

1. Larvaya odaklanmış kamera portu LED'i ile diseksiyon mikroskobu aşamasında Ca²⁺ içermeyen salini normal salin (FM1-43 boyası olmadan) ile değiştirin.
2. Boşaltma için stimülatör parametrelerini ayarlayın (örn. 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süre ve 2 dakikalık süre (Şekil 2).
3. Işık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca bir zamanlayıcı ile takip edin (örn., 2 dakika; Şekil 2).
4. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için Ca²⁺ içermeyen tuzlu su ile değiştirin.
5. Dış boyanın tamamen çıkarıldığından emin olmak için Ca²⁺ içermeyen tuzlu su ile (1 dakika boyunca 5x) hızlı bir şekilde arka arkaya yıkayın.
6. Konfokal mikroskop ile anında görüntüleme için larva preparatını taze Ca²⁺ içermeyen tuzlu suda tutun.
7. FM1-43 boya floresansını aynı konfokal ayarları kullanarak yukarıda belirtilen aynı NMJ'de görüntülediğinizden emin olun.

Sonuçlar

Şekil 1: Drosophila NMJ'deki FM1-43 boya yükleme protokolünün akış şeması. Larva tutkal diseksiyonu, ventral sinir kordonu (VNC) segmental sinirleri ventral orta hattan (Vm) hemisegmental olarak tekrarlanan vücut duvarı kas dizilerine (adım a) yansıtarak düzleştirilmiş bir nöromüsküler sistem preparatı üretir. VNC serbest bırakılır ve tüm larva diseksiyonu daha sonra stimülasyona hazırlık olarak pembe...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SylGard 184 Silikon Elastomer Kiti	Balıkçı Bilimsel	NC9644388	Diseksiyonlar için kapak camı koymak için
Mikroskop Kapak Camı 22x22-1	Balıkçı markası	12-542-B	Diseksiyonlar için SylGard'ı koymak için
Alüminyum Üst Sıcak Plaka Tipi 2200	Termolin	HPA2235M	SylGard'ı iyileştirmek için
Pleksi cam diseksiyon odası	Yok	Yok	El yapımı
Borosilikat Cam Kılcal Damarlar	TEFE	1B100F-4	Emme ve tutkal mikropipetleri yapmak için
Lazer Tabanlı Mikropipet Çektirme	Sutter Enstrümanı	P-2000	Emme ve tutkal mikropipetleri yapmak için
Tygon E-3603 Laboratuvar Hortumu	Bileşen Tedarik A.Ş.	TET-031A	Ağız ve emme pipeti için
P2 pipet ucu	ABD Bilimsel	1111-3700	Ağız pipeti için
0,6 mL Eppendorf tüp kapağı	Balıkçı Bilimsel	05-408-120	Diseksiyon için yapıştırıcı koymak için kullanılır
Vetbond 3M Ürün Mağazası	TEFE	Veteriner Tahvili	Diseksiyonlar için kullanılan yapıştırıcı
Potasyum Klorür	Balıkçı Bilimsel	P-217	Forsaline
Sodyum Klorür	Kırlangıç Sigma	S5886 Serisi	Tuzlu su için
Magnezyum Klorür	Balıkçı Bilimsel	M35-500	Tuzlu su için
Kalsiyum Klorür Dihidrat	Kırlangıç Sigma	C7902	Tuzlu su için
Sakaroz	Balıkçı Bilimsel	S5-3 Serisi	Tuzlu su için
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson İmmün Araştırma	123-605-021	Nöronal zarları etiketlemek için
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Kırlangıç Sigma	H3375	Tuzlu su için
Paintbrush	Winsor ve Newton	94376864793	Larvaları manipüle etmek için
Dumont Dumostar Cımbız #5	TEFE	500233	Diseksiyon sırasında kullanılır
7 cm McPherson-Vannas Mikromakas (bıçaklar 3 mm)	TEFE	14177	Diseksiyon sırasında kullanılır
FM1-43	Balıkçı Bilimsel	T35356	Floresan stiril boya
Dijital Zamanlayıcı	VWR (VWR)	62344-641	FM boya yükleme/boşaltma zamanlaması için
LSM 510 META lazer taramalı konfokal mikroskop	Zeiss		Floresan işaretleyicileri görüntülemek için
Zen 2009 SP2 sürüm 6.0	Zeiss		Konfokal görüntüleme için yazılım
HeNe 633nm lazer	Lasos Plajı	Görüntüleme sırasında HRP:647'yi uyarmak için
Argon 488nm lazer	Lasos Plajı		Görüntüleme sırasında FM boyasını uyarmak için
Mikro Dövme	TEFE	MF200	Cam mikropipetleri ateşle parlatmak için
Uyarıcı	çimen	S48 Serisi	LED'i ve elektrik stimülasyonunu kontrol etmek için
All-trans Retinal	Kırlangıç Sigma	R2500	ChR2 için temel kofaktör
Kamera portlu Zeiss Stemi Mikroskop	Zeiss	2000-C	Lovardopsin stimülasyonu sırasında kullanılır
LED 470nm	Thor Laboratuvarları	M470L2	ChR aktivasyonu için kullanılır
T-Cube LED Sürücü	Thor Laboratuvarları	LEDD1B	LED'i kontrol etmek için
LED Güç Kaynağı	Cincon Elektronik A.Ş.	TR15RA150	LED'e güç sağlamak için
Optik Güç ve Enerji Ölçer	Thor Laboratuvarları	PM100D	LED yoğunluğunu ölçmek için
40X Achroplan Suya Daldırma Hedefi	Zeiss	Elektriksel stimülasyon ve konfokal görüntüleme sırasında kullanılır