>1. Larva Tutkal Diseksiyonu
- 10 kısım silikon elastomer tabanı, elastomer kitinden (Malzeme Tablosu) 1 kısım silikon elastomer kürleme maddesi ile iyice karıştırın.
- 22 x 22 mm cam lamelleri elastomer ile kaplayın ve sıcak bir plaka üzerinde 75 °C'de birkaç saat kürleyin (artık dokunulduğunda yapışkan olmayana kadar).
- Larva diseksiyonuna hazırlık olarak özel yapım pleksiglas diseksiyon odasına (Şekil 1, alt) tek bir elastomer kaplı cam lamel yerleştirin.
- İstenen konik ve uç boyutunu elde etmek için standart bir mikroelektrot çektirmesi kullanarak tutkal pipetlerini borosilikat cam kılcal damardan hazırlayın.
- Mikropipet ucunu nazikçe kırın ve diğer ucuna 2 ft esnek plastik tüp (1/32" iç çap, ID; 3/32" dış çap, OD; 1/32" duvar; Malzeme Tablosu) ağza oturan (P2 pipet ucu).
- Larva diseksiyonuna hazırlık olarak küçük bir kabı (0.6 mL Eppendorf tüp kapağı) küçük hacimli (~ 20 μL) tutkalla (Malzeme Tablosu) doldurun.
- Hazneyi tuzlu su ile doldurun (mM cinsinden): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sükroz ve 5 2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES) pH 7.2.
- Diseksiyon sırasında nöromüsküler kavşak (NMJ) presinaptik terminalini etiketlemek için Alexa Fluor 647'ye (anti-HRP: 647; 1 mg / mL stoktan 1:10 seyreltin) konjuge edilmiş anti-at turp peroksidaz (HRP) antikoru ekleyin.
- İnce bir boya fırçası (2 numara) kullanarak, dolaşan üçüncü bir instar larvasını gıda şişesinden çıkarın ve elastomer kaplı kapak camına yerleştirin.
- Cam mikropipet ucunu, bağlantı ile ağız tarafından oluşturulan negatif hava basıncını kullanarak küçük bir hacimde yapıştırıcı ile doldurun (adım 1.5).
- Larva sırt tarafı yukarı bakacak şekilde forseps ile konumlandırın ve ağızdan pozitif hava basıncı kullanarak kafayı küçük bir damla yapıştırıcı ile elastomer kaplı lamel üzerine yapıştırın.
- Bu işlemi larvanın arka ucu ile tekrarlayın ve hayvanın iki tutkal eki arasında gergin bir şekilde gerildiğinden emin olun.
- Makas kullanarak (bıçaklar 3 mm; Malzeme Tablosu), posteriorda yatay bir kesim (~ 1 mm) ve dorsal orta hat boyunca dikey bir kesim yapın.
- İnce forseps (# 5, Malzeme Tablosu) kullanarak, dorsal trakea, bağırsak, yağ gövdesi ve kas sistemini kaplayan diğer iç organları nazikçe çıkarın.
- Gövde duvarını hem yatay hem de dikey olarak nazikçe gerdiğinizden emin olarak dört gövde duvarı kanadı için yapıştırma prosedürünü tekrarlayın.
- Forseps kullanarak ventral sinir kordonunu (VNC) kaldırın, motor sinirleri makasla dikkatlice kesin ve ardından VNC'yi tamamen çıkarın.
- Sinaptik vezikül (SV) döngüsünü durdurmak için diseksiyon salinini Ca2+ içermeyen salin ile (CaCl2 içermeyen yukarıdaki diseksiyon saliniyle aynı) değiştirin.
2. Görüntüleme: Konfokal Mikroskopi
- NMJ boya floresansını görüntülemek için 40X suya daldırma objektifine sahip dik bir konfokal mikroskop kullanın (diğer mikroskoplar kullanılabilir).
- Karın segmentleri 2-4'ün 4 NMJ'sini görüntüleyin (diğer NMJ'ler görüntülenebilir) ve uygun yazılımı kullanarak görüntüleri toplayın (Malzeme Tablosu).
- HRP:647'yi uyarmak için bir HeNe 633 nm lazer (635 nm > uzun geçiren filtre ile) ve FM1-43'ü uyarmak için bir Argon 488 nm lazer (530-600 nm bant geçiren filtre ile) kullanın.
- Her iki kanal için optimum kazancı ve ofseti operasyonel olarak belirleyin.
not: Bu ayarlar, deneyin geri kalanı boyunca sabit kalacaktır.
- Sinaptik terminalin HRP işaretli üstünden aşağıya doğru seçilen tüm NMJ boyunca konfokal bir Z-yığını alın.
- FM boya boşaltma işleminden sonra tam olarak aynı NMJ'ye fazlalık olduğundan emin olmak için görüntülenen NMJ'yi (segment, yan ve kas) dikkatlice not edin.
3. Channelrhodopsin Stimülasyonu FM Boya Yükleme
- ChR2 ko-faktör all-trans retinal (etanol içinde çözülmüş; 100 μM nihai konsantrasyon) içeren gıdalarda ChR2 eksprese eden larvaları yükseltin.
- Larva preparatını, bir kamera portu ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu tablası üzerindeki pleksiglas hazneye yerleştirin.
- Mavi bir LED (470 nm; Malzeme Tablosu) bir koaksiyel kablo kullanarak programlanabilir bir stimülatöre bağlayın ve LED'i kamera bağlantı noktasına yerleştirin.
- Mikroskop yakınlaştırma işlevini kullanarak mavi LED ışık huzmesini disseke edilmiş larva işlevine odaklayın.
- Larva preparatındaki Ca2 + içermeyen salini, optogenetik aşamada yukarıdaki FM1-43 salin (4 μM; 1 mM CaCl2) ile değiştirin.
- Stimülatörü kullanarak LED parametrelerini ayarlayın (örn. 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süre ve 5 dakikalık süre (Şekil 2)).
- Işık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca bir zamanlayıcı ile takip edin (örn., 5 dakika; Şekil 2).
- Zamanlayıcı durduğunda, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için Ca2+ içermeyen tuzlu su ile değiştirin.
- FM boya solüsyonunun tamamen çıkarıldığından emin olmak için Ca2+ içermeyen tuzlu su ile (1 dakika boyunca 5x) hızlı bir şekilde arka arkaya yıkayın.
- Görüntüleme protokolünü kullanarak konfokal mikroskop ile anında görüntüleme için larva preparatını taze Ca2+ içermeyen tuzlu suda tutun.
- FM boya boşaltma işleminden sonra tam olarak aynı NMJ'ye erişim sağlamak için görüntülenen NMJ'yi (segment, yan ve kas) dikkatlice not edin.
4. Channelrhodopsin Stimülasyonu: FM Boya Boşaltma
- Larvaya odaklanmış kamera portu LED'i ile diseksiyon mikroskobu aşamasında Ca2+ içermeyen salini normal salin (FM1-43 boyası olmadan) ile değiştirin.
- Boşaltma için stimülatör parametrelerini ayarlayın (örn. 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süre ve 2 dakikalık süre (Şekil 2).
- Işık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca bir zamanlayıcı ile takip edin (örn., 2 dakika; Şekil 2).
- Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için Ca2+ içermeyen tuzlu su ile değiştirin.
- Dış boyanın tamamen çıkarıldığından emin olmak için Ca2+ içermeyen tuzlu su ile (1 dakika boyunca 5x) hızlı bir şekilde arka arkaya yıkayın.
- Konfokal mikroskop ile anında görüntüleme için larva preparatını taze Ca2+ içermeyen tuzlu suda tutun.
- FM1-43 boya floresansını aynı konfokal ayarları kullanarak yukarıda belirtilen aynı NMJ'de görüntülediğinizden emin olun.
