In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de Sinaptik Lokalize Kalsiyum Sensörleri Kullanılarak Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Kaynak: Hancock, C. E. ve diğerleri, Drosophila melanogaster'de Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisitenin İn Vivo Optik Kalsiyum Görüntülemesi.J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, sineklerde sinaptik olarak lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Sinekleri mikroskopi için hazırlamak, koku alma koşullandırması yapmak ve koku kaynaklı kalsiyum akışını görselleştirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

1. Transgenik meyve sinekleri, Drosophila melanogaster

1. Çapraz dişi bakire ve erkek sinekler (12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde% 60 bağıl nemde 25 ° C'de yükseltilir), istenen Gal4 ve UAS yapılarını taşır ve ilgilenilen belirli nöronların genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesini ifade ettiği sinekler üretir.
2. Yukarıdaki melezin dişi döllerini, eklosiyondan 3-6 gün sonra 3-6 gün aralığına gelene kadar yaşlandırın. Dişi sinekler biraz daha büyük olmaları nedeniyle tercih edilir.

2. Meyve sineğinin in vivo kalsiyum görüntüleme için hazırlanması

1. Tek bir dişi sinek seçin ve 5 dakikadan fazla olmamak üzere buz üzerinde anestezi uygulayın.
2. İnce forseps kullanarak, sineği görüntüleme odasına yerleştirin (Şekil 1c'de gösterilmiştir). Göğüs kafesi ve bacakların haznenin altındaki elektrik telleriyle temas halinde olduğundan ve başın düz durduğundan emin olun. Şeffaf yapışkan bant kullanarak sineğin konumunu sabitleyin.
   not: Bu protokol, sineklerin sabitlendiği, kafa kapsülünün açılması için erişilebilir olduğu ve sineklerin hem antenlere koku uyarımlarını hem de göğüs kafesi ve bacaklara elektrik şoklarını alabildiği, özel olarak yapılmış bir oda gerektirir (Şekil 1).
3. Neşter sapına sabitlenmiş bir cerrahi neşter bıçağı kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), sineğin başının etrafındaki bantta bir pencere açın, antenleri kapalı ve göğüs kafesinin sadece en ön kısmını açıkta bırakın.
4. Başın yanlarını ve arkasını, içbükey dışbükey çeneler tarafından tutulan bir böcek pimi kullanılarak dikkatlice manipüle edilen mavi ışıkla sertleştirici yapıştırıcı ile çevreleyin. Mavi ışık yayan bir LED lamba kullanarak yapıştırıcıyı ayarlayın.
5. Yapıştırıcının tamamen ayarlandığını kontrol edin ve sinek kafasının sırt yüzeyindeki sertleştirilmemiş yapıştırıcı kalıntılarını temizleyin.
6. Başın açıkta kalan kütikülünü kaplamak için bir damla Ringer solüsyonu uygulayın (Malzeme Tablosuna bakın).
7. Çok ince ağızlı bir bıçak bıçağı kullanarak kütikülü kesin. Kütikülün en verimli şekilde çıkarılması için, önce ocelli'yi başlangıç noktası olarak kullanarak başın arka tarafını kesin. Daha sonra, forseps kullanılarak kolayca yırtılabilen bir kütikül kanadı oluşturmak için gözlerin medialinde her iki tarafı kesin.
8. Beynin ilgilendiği bölgeyi tıkayabilecek fazla kütikülü çıkarın.
9. Beyin dokusunun kendisinin bozulmasını önleyerek ince forseps kullanarak herhangi bir trakeanın sırt yüzeyini dikkatlice temizleyin. Doku kalıntıları alanını temizlemek için Ringer solüsyonunu (Malzeme Tablosuna bakınız) çıkarın ve yenileyin.
10. Hipodermik koku verme iğnesini sineğin başından yaklaşık 1 cm uzakta bir konuma yerleştirin. Antene koku iletimini engelleyebilecek hiçbir şey olmadığından emin olun.
11. Mikroskopta, görüntüleme odasını hipodermik koku verme iğnesi aracılığıyla koku verme sistemine bağlayın.
12. Sineğin anestezi ve ameliyattan tamamen kurtulmasını ve hava akımına uyum sağlamasını sağlamak için bu aşamada 10 dakikalık bir dinlenme süresi uygulayın.

3. İn vivo kalsiyum görüntüleme

1. Titreşim yalıtımlı bir masaya monte edilmiş, kızılötesi lazer ve suya daldırma objektifi ile donatılmış bir çoklu foton mikroskobu kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Yeşil floresan protein (GFP) bazlı kalsiyum indikatörlerinin görselleştirilmesi için lazeri 920 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ayarlayın ve bir GFP bant geçiren filtre takın.
2. Kaba Z ayar düğmesini kullanarak beynin Z eksenini tarayın ve ilgilenilen beyin bölgesini bulun. Tarama süresini en aza indirmek ve tarama görünümünü başın ön kısmı aşağı bakacak şekilde döndürmek için taramayı yalnızca bu alana odaklamak için kırpma işlevini kullanın.
3. Çerçeve boyutunu 512 x 512 piksele, tarama hızını > 4 Hz'ye ve tarama bölgesini (Y boyutunda) ilgilenilen nöronları kapsayacak şekilde ayarlayın.

4. Koku alma koşullandırması yoluyla koku ile uyarılan kalsiyum geçişlerinin görselleştirilmesi

1. Birkaç koku uyaranını zamansal olarak hassas bir şekilde iletebilen bir koku dağıtım sistemi kullanın.
   1. Cihazı kontrol etmek ve deneyler sırasında görüntü yakalama ile koku stimülasyonlarını koordine etmek için görüntüleme mikroskobu yazılımıyla iletişim kurmak için ek bir bilgisayar kullanın.
   2. Ayrı bir programda bir koku verme protokolünün başlatılmasıyla sağlanan harici bir giriş tetikleyicisine yanıt veren görüntü alma yazılımı ile koku dağıtım programını (örneğin, mikroskop kontrol yazılımına yüklenmiş bir VBA makro paketi, Malzeme Tablosuna bakın) bağlayabilen önceden programlanmış bir makro paketini başlatın.
2. 512 x 512 piksel çözünürlükte ve 4 Hz kare hızında "ön eğitim"/saf koku ile uyarılmış kalsiyum geçici akımlarını izleyerek ölçümü başlatın. Koku başlangıcından 6,25 s önce (F₀ referans değer oluşturmak için) ve koku ofsetinden 12,5 s sonra ek görüntü alımıyla desteklenen 2,5 s'lik bir koku uyaranı sağlayın. Bunu ikinci bir koku verici ile ve ardından üçüncü bir koku verici ile tekrarlayın.
3. Bu ölçümden 3 dakika sonra sineği klasik koşullandırma ("eğitim") ile devam edin.
   1. "Eğitim öncesi" aşamasında sunulan kokulardan birini koşullu uyaran (CS⁺) kokusu olacak şekilde seçin ve diğerini CS kokusu olacak şekilde seçin. On iki adet 90 V elektrik şokunun yanı sıra 60 saniye boyunca bilgisayar kontrollü koku verme sistemini kullanarak CS⁺ kokusunu sunun.
   2. 60 sn aradan sonra, ^CS-kokusunu 60 sn boyunca tek başına sunun. Koku verici olarak 4-metilsikloheksanol ve 3-oktanol kullanın. Bu eğitim sırasında üçüncü koku vericiyi (örn. 1-okten-3-ol) sunmayın, çünkü bu yalnızca eğitim aşamasından önce (adım 4.2.) ve sonrasında (adım 4.4) kontrol olarak kullanılır.
4. Eğitim aşamasını bitirdikten 3 dakika sonra (adım 4.3) "eğitim öncesi" koku stimülasyon protokolünü (adım 4.2.) tekrarlayarak "eğitim sonrası" koku ile uyarılan kalsiyum geçişlerini tekrar ölçün.
   not: Bu adımın zamanlaması, hafıza oluşumundan sonraki ilgi süresini yansıtmalıdır (örneğin, kısa süreli hafızayı araştırmak için bu adımı koşullandırma adımından 3-4 dakika sonra gerçekleştirin). Tipik olarak, sinekler bu hazırlıkta birkaç saat hayatta kalabilir.
5. Görüntüleme dosyalarını daha sonra görüntü analizi için uygun bir formatta (ör. Tiff) kaydedin.

5. Görüntü analizi

1. Görüntüleri analiz etmek için, Fiji gibi görüntü analiz yazılımında Tiff (veya benzeri) dosyaları açın.
2. X ve Y yönlerinde minimum hareket sağlamak için bir hareket düzeltme algoritması kullanarak yığınları hizalayın. Z ekseninde güçlü hareket gösteren tüm kayıtları atın.
3. İncelenecek alanın etrafındaki bir ilgi bölgesini (ROI) işaretlemek için kullanılan yazılım aracını seçin. Bu, arka plan floresansının etkisini sınırlamak için mümkün olduğunca kesin olmalıdır.
4. Kaydın her karesi için bir değer oluşturulacak şekilde, seçilen ROI'den zamansal floresan yoğunluğu verilerini veri dosyaları olarak çıkarmak için ilgili yazılım aracını kullanın.
5. Her koku izi için ΔF/F₀ değerlerini hesaplamak için bir veri analiz programı kullanarak verileri açın. F₀ = koku başlangıcından önceki 2 saniyedeki ortalama floresan. ΔF = belirli bir çerçevedeki ham floresan ile F₀ arasındaki fark. Bu değerlerden, koku uyaran periyodu boyunca bağıl floresansı yansıtmak için zamana karşı çizilebilen her kare için bir ΔF/F₀ değeri hesaplayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Bir montaj odasının inşası ve görüntüleme için bir sineğin hazırlanması.(a) Sinek montaj odasının inşası için adımlar. Taban, ince bir plastik ağ (2) ile kaplanmış standart bir mikroskop lamından (1) oluşur. Zıt yükler (3) taşıyan iki elektrik kablosu, her iki taraftaki kızağa yapıştırılmıştır. Teller, birbirine paralel uzanan ancak temas halinde olmayan sürgüyü (4) geçmek iç...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-Okten-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	O5284	Koku verici olarak kullanılan kimyasal
3-Oktanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	218405	Koku verici olarak kullanılan kimyasal
4-Metilsikloheksanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	153095	Koku verici olarak kullanılan kimyasal
EGFP için bant geçiren filtre (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almanya
Şeffaf yapışkan bant	Tesa SE, Norderstedt, Almanya		Standart şeffaf yapışkan bant
İçbükey dışbükey çeneler	Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, Kanada	10053-09	İçbükey dışbükey çeneli Bıçak Tutucular
İnce forseps	Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, Kanada	11412-11	Uçlu forseps 0,1 x 0,06 mm
Hipodermik iğne	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Almanya	4665120	1,20x40 mm
Böcek Minutien pimleri	Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, Kanada	26002-10	Çap 0,1 mm, uç 0,0125 mm
Kentoflow (Kentoflow)	Kent Express Diş Malzemeleri, Gillingham, Birleşik Krallık	953683	Mavi ışıkla sertleşen yapıştırıcı
Mikroskop lamı	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Almanya	656.1	Standart objektif sürgüsü 76 x 26 mm
Mineral yağ	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	M8410	Koku vericiler için seyreltici olarak kullanılır
Mod kilitli Ti-Safir lazer Chameleon Vision 2	Tutarlı Inc., Santa Clara, CA, ABD		Ayarlanabilir kızılötesi femtosaniye lazer
BiG dedektörleri ile donatılmış Multifoton Mikroskobu LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almanya		Çoklu foton mikroskobu, birden fazla şirket benzer cihazlar sağlar.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) suya daldırma objektifi	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almanya	421452-9900-000	Objektif W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer'ın çözümü	N.A.	N.A.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sükroz, pH = 7.4
Bıçak bıçağı	Sharpoint, Cerrahi Uzmanlıklar Şirketi, Okuma, PA, ABD	72-1551	5,0 mm Düz kısıtlı bıçak derinliği
Cerrahi neşter bıçağı	Swann-Morton, Sheffield, Birleşik Krallık	303	Ürün No. 11
Cerrahi neşter sapı	Swann-Morton, Sheffield, Birleşik Krallık	907	Ürün No. 7S/S
Koku verme cihazından bir tetikleyici almak için Visual Basics of Applicatons (VBA) yazılımı ve elektrik çarpması uygulama cihazından (güç kaynağı) mikroskobu kontrol eden Zeiss'ın ZEN yazılımı ile etkileşime girmek için.	Özel olarak yazılmış ve istek üzerine temin edilebilir	N.A.	N.A.

Serisi Serisi