Bir Mikroelektrot Dizi Sistemi Kullanılarak Ultrason Kaynaklı Nöromodülasyon

Abstract

Kaynak: Liang, R. et al., Çok Kuyulu Mikroelektrot Dizilerinde İnsan İn Vitro Nöral Kültürlerinin Odaklanmış Ultrason Nöromodülasyonu. J. Vis. Uzm. (2024)

Bu video, çok kuyulu bir mikroelektrot dizisinde veya odaklanmış bir ultrason dönüştürücü kullanarak MEA sisteminde kültürlenmiş insan iPSC'den türetilmiş nöronlarda nöral aktivitenin modülasyonunu indükleme yöntemini gösterir.

Protocol

1. Malzemelerin hazırlanması

1. Kültür ortamını aspire edin ve 24 oyuklu bir nöron kültür plakasındaki tek bir kuyuyu gömülü bir mikroelektrot dizisi (MEA) ile doldurmak için kullanın (Şekil 1A).
2. Parafilm arayüzünü, lastik bandı ve odaklanmış ultrason (FUS) konisini kauçuk zarı ile %70 etanol kullanarak 10 dakika sterilize edin ve daha sonra monte etmek üzere çeker ocak içine yerleştirin.
3. 300 mL deiyonize su ve 50 mL birleştirme jelinin gazını alın. Birleştirme ortamında kavitasyona neden olmamak için suyu ve jeli 160 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   not: İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (HiPSC'ler) orijinal kaynağı GM01582 ve CIPS hücre hatlarındandır. Ortalama olarak, kuyu başına 5 x 10⁴ motor nöron ve 2.5 x 10⁴ astrosit yoğunluğu elde edilebilir.

2. Çevre birimlerinin bağlantısı ve kurulumu

1. FUS konisini vidalar kullanarak dönüştürücüye sabitleyin ve koniyi havalandırmalı steril bir başlıkta esnek bir kauçuk membranla kapatın. Koniyi adım 1.3'ten itibaren gazı alınmış ve deiyonize edilmiş (DG-DI) suyla doldurun ve kavitasyonu önlemek için konide kabarcık olmadığından emin olun.
2. 3D baskılı tutucuyu bir çerçeveye sabitlemek için özelleştirilmiş bir dişli çubuk kullanın (Şekil 1B). Çerçeveyi, FUS dönüştürücünün kafası uyarılacak kuyunun üzerinde olacak şekilde konumlandırın.
3. Ortamı ve HiPSC'leri içeren 24 oyuklu MEA plakası üzerindeki kuyu üzerine parafilm sabitlemek için bir lastik bant kullanın.
4. Ultrason dönüştürücüsünün arka uç sürücü elektroniğini, bu durumda dönüştürücü güç çıkışını (TPO) 100-240 V'luk bir elektrik prizine bağlayarak ve eşleşen ağı TPO ve FUS dönüştürücüye bağlayarak FUS sistemini hazırlayın. Eşleşen ağ, dönüştürücü ve TPO arasında verimli bir elektrik bağlantısı sağlar.
5. MEA sistemini bir elektrik prizine (100-240 V) bağlayın (Şekil 2B, Bağlantı 5). MEA sistem senkronizasyon bağlantı noktasını TPO'ya bağlayın (Şekil 2B, Bağlantı 3). Bu bağlantı, MEA sistemi tarafından veri alımını FUS stimülasyonu ile senkronize edecektir.
6. 24 oyuklu MEA plakasını MEA sistemine yerleştirin ve dönüştürücü ile kuyu arasında doğrudan teması sağlamak için kapağı çıkarın. Adım 5'de açıklandığı gibi, gazı alınmış kuplaj jeli için yer açmak için dönüştürücüyü kuyu plakasının 10-3.2 mm üzerine yerleştirin (Şekil 2A ve Şekil 1B).

3. Stimülasyon ve nöronal sinyal alımı

1. TPO kontrol panelinde FUS parametrelerini ayarlayın (Tablo 1).
2. Birleştirme jelini parafilmin üzerine uygulayın ve FUS dönüştürücüyü birleştirme jelinin içine indirin, jel ile minimum hava kabarcığı ile teması sağlayın (Şekil 1A).
3. Kullanıcı arayüzündeki Başlat düğmesine tıklayarak MEA sistem kaydını başlatın.
4. TPO'daki sağ alt düğmeye basarak FUS sonikasyonunu başlatın (Şekil 2A, Etiket 7) ve nöronların temel duruma dönmesine izin vermek için her sonikasyon turu arasında en az 5 dakika bekleyin.
5. FUS stimülasyon dizisini MEA kaydına hizalamak için FUS sistemi tarafından üretilen tetikleme darbesini kullanın (Şekil 1B, Bağlantı 3).

Tablo 1: TPO'da ayarlanan odaklanmış ultrason (FUS) parametreleri

) Sertifikası

parametre	değer
Maksimum Güç/Kanal	1.200 W
Olgusal	0.749 W/kanal
ISPPA (ISPPA	10,79 G/cm2
ISPTA (ISPTA)	0,05 W/cm2
Seri Çekim Uzunluğu	0.100 ms
frekans	250,00 kHz
odak	39.800 Milimetre
dönem	20.000 ms
Zamanlayıcı	60.000 saniye

Results

Resim 1: Çok kuyulu mikroelektrot dizisi (MEA) ile FUS nöromodülasyonu. (A) Çok kuyulu MEA ile FUS nöromodülasyonu için kurulumun şeması. FUS dönüştürücü tarafından üretilen akustik dalgalar, gazı alınmış su ile doldurulmuş bir FUS konisi boyunca yayılır ve ultrason jeli kullanılarak birleştirilir. Parafilm, kontaminasyonu önlemek için bir lastik bant kullanılarak kuyuya sabitlenir. M...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEA Sistemi	Axion Biyosistem A.Ş.	Maestro Kenar	Örnekleme Hızı: 11500 Hz
MEA Plakası	Axion Biyosistem A.Ş.	SitoView MEA	Elektrot ve Kuyu: 24 kuyuda 16 elektrot
Kuyu plakası Arayüzü	Amcor A.Ş.	Parafilm PM996; P7793 Serisi	Kalınlık: 127 μm
Kültür için CO2 Tankı ve Regülatörü	AirGas Inc. / Harris Inc.	9296NC	Konsantrasyon: %5
Kültür Medyası	ThermoFisher A.Ş.	Laminin; 23017-015	Konsantrasyon: 1 μg/mL
HiPSC Nöronları	Peprotech teknolojisi	CIPS ve GM01582 Türetilmiş; 450-10	Konsantrasyon: 10 ng/mL (Bkz. Taga ve ark. [2021]13)
Dönüştürücü	Sonic Kavramları A.Ş.	CTX250; 008	Merkez Frekansı: 250 kHz
Eşleşen Ağ	Sonic Kavramları A.Ş.	CTX250; NFS102v2 (İngilizce	Empedans: 50 Ω
Dönüştürücü Güç Çıkışı (TPO)	Sonic Kavramları A.Ş.	Sürüm 4.1; 020	Frekans: 250 kHz'den 2,5 MHz'e
zar	McMaster A.Ş.	Silikon Kauçuk; 5542N115	Kalınlık: 0.0127 cm
Kaplin Jeli	Parker Laboratuvarı A.Ş.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Viskozite: 130.000–185.000 cops
Prob tutucuya bağlantı	McMaster A.Ş.	Dişli Çubuk Çalmak; 90322A661	Uzunluk: 1–1/2" Uzun
Hidrofon	Sonic Kavramları A.Ş.	Y-104; 009	Aralık: 50 kHz–1,9 MHz
Su Tankı	Sonic Kavramları A.Ş.	Wt	Boyut: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Su Şartlandırma Ünitesi	Sonic Kavramları A.Ş.	WCU; SN006	Akış Hızı: Maksimum 50 mL/s
Osiloskop	Rohde-Schwarz A.Ş.	RTC1002	Örnekleme hızı: 50 MHz'e kadar
safha	Sonic Kavramları A.Ş.	Mikro Aşama; 2	Doğruluk: 1 μm
Termokromik levha	TIPTEMP A.Ş.	Sıvı Kristal Levha; TLCSEN337	Aralık: 22–24 °C
bilgisayar	Microsoft Surface	Surface Pro	İşlemci i5 1035G4: 3.7 GHz
Veri Aktarım Yazılımı	Matematik İşleri A.Ş.	MATLAB (MATEMAT)	Sürüm 2021b
İşleme Yazılımı	Python Yazılım Vakfı	piton	Sürüm 3.7.10