>1. Kayıtlardan Önce Kurulum
- Kayıt çözeltilerini Tablo 1'de gösterildiği gibi iyon konsantrasyonları ile hazırlayın.
- MgCl2, CaCl2, KCl ve CsCl için ultra saf suda 15 mL 2 M stok çözeltileri hazırlayın.
- Tablo 1'e göre 100 mL hücre içi ve 500 mL hücre dışı tamponlu çözeltiler için katı bileşenleri ayrı beherlere tartın ve daha sonra hazırlanan stok çözeltilerinin ilgili miktarını ekleyin. Örneğin, hücre içi tampon için 0.3803 g (10 mM) EGTA (etilen glikol tetraasetik asit), 0.2383 g (10 mM) HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit) ve 0.6428 g (110 mM) NaCl kullanın ve 100 μL 2 M MgCl2 ve CaCl2 ve 50 μL 2 M KCl ve CsCl stok çözeltileri.
- Ultra saf su ekleyin ve ölçüme müdahale etmeyen, yani sitrik asit ve N-metil-D-glukamin (NMG +) gibi ChR (Channelrhodopsins) tarafından gerçekleştirilmeyen asitler ve bazlar kullanarak pH'ı dikkatlice ayarlayın.
- Ozmolariteyi hücre içi için 290 mOsm'ye ve glikozlu hücre dışı çözeltiler için 320 mOsm'ye ayarlayın.
not: Hafif hipoozmotik hücre içi solüsyonlar yamanın başarı oranını arttırır.
- Steril filtre: tüm çözeltiler 0,22 μm filtrelerden geçirilir. Solüsyonları iki hafta boyunca 4 °C'de saklayın veya uzun süreli depolama için -20 °C'de dondurun.
- Sıvı bağlantı potansiyellerini hesaplayın ve kayıt protokollerini hazırlayın.
NOT: Tüm hücre konfigürasyonu oluşturulduktan sonra hücre dışı klorür konsantrasyonunun değişmesi, düzeltilmesi gereken önemli bir sıvı bağlantı potansiyeline (LJP) neden olur. LJP'ler doğrudan ölçülebilir veya hesaplanabilir, burada ikinci seçenek kullanılır. Bu protokolde, her harici arabellek için bir kayıt protokolü talep eden çevrimiçi düzeltme kullanılacaktır. Bununla birlikte, daha büyük bir harici çözüm seti için, yanlış düzeltmeyi önlemek için LJP'nin sonradan düzeltilmesi önerilir.
- Kavşak potansiyeli hesaplayıcısını (JPC) açın ve 'Yeni Deney' iletişim kutusunu açın. Ardından "Yama kelepçesi ölçümleri" ni seçin. "Tam hücre ölçümleri" ve "Standart tuz çözeltisi elektrodu"nu seçin ve 25 °C'lik bir sıcaklık girin. Her adım arasında, "ileri" düğmesine basarak seçimi kabul ederek ilerleyin.
NOT: Deneyler 25 °C oda sıcaklığında, klimalı bir laboratuvarda gerçekleştirilmiştir. Deneylere başlamadan önce tampon çözeltilerinin oda sıcaklığına sahip olduğundan emin olun. Numune sıcaklığını değiştirmek için bir inkübasyon aşaması veya odası kullanılabilir. Banyo sıcaklığı bir termometre ile sık sık ölçülebilir.
- Pipetlenmiş çözeltinin tüm bireysel anyon ve katyon konsantrasyonlarını ve yüksek klorür tamponunu Tablo 1.
'da listelenen konsantrasyonlara göre ekleyin
not: JPC, başlangıç koşulları için -0,5 mV'luk bir LJP hesaplayacaktır.
- Düşük klorür tamponunun anyonik ve katyonik bileşimini girmek için "Yeni Banyo Çözeltisi"ne tıklayın.
not: JPC şimdi değiştirilen hücre dışı kayıt çözümüne göre +12,6 mV'luk yeni bir LJP hesaplayacaktır.
- Hesaplanan LJP'yi uygulanan tutma potansiyelinden çıkararak iki ölçüm koşulu için LJP ile düzeltilmiş iki protokol hazırlayın; yüksek klorür harici çözeltiler için -0.5 mV ve düşük klorür harici çözeltiler için +12.6 mV. Bu nedenle, protokoller sırasıyla -79.5 mV (yüksek klorür) ve -92.6 mV (düşük klorür) ile başlar ve her iki durumda da -80 mV'luk bir LJP düzeltmeli başlangıç tutma potansiyeli elde eder.
not: Aşağıdaki adımlar, malzeme listesinde belirtilen veri toplama yazılımı için geçerlidir.
- Edinme yazılımında protokol düzenleyicisini açın. "Mod" menüsünden "Epizodik stimülasyon"u seçin ve 7 tarama ekleyin.
- Düzenleyicideki "Dalga Formu" menüsüne geçin ve 0 mV tutma potansiyeline sahip 200 ms'lik bir periyot ve ardından yüksek klorür için -79,5 mV'den başlayan değişen tutma potansiyeline sahip 2 s'lik bir periyot ekleyin. Her taramada tutma potansiyelini 20 mV artırmak için ikinci periyot için 20 mV'luk bir "Delta seviyesi" ekleyin.
- Dalga formu düzenleyicisinin voltaj adımları içinde, 540 nm ışıkla (3,10 mW/mm²) 500 ms'lik bir aydınlatma periyodu uygulayın. Bunu yapmak için, yukarıda açıklanan ikinci periyottan 500 ms sonra ışık kaynağını aktif olacak şekilde kontrol eden bağlı deklanşörün "dijital bit modelini" değiştirin (bkz. 1.2.6).
not: Işık yoğunluğu, kanal akımlarının genlik veya inaktivasyon gibi biyofiziksel özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, ışık gücü yoğunlukları her zaman rapor edilmelidir. Tüm optiklerden ve lamel geçtikten sonra ışık gücünü ölçmek için kalibre edilmiş bir optometre kullanın. Güç yoğunluğunu hesaplamak için, hedefin aydınlatılan alanını bir nesne mikrometresi ile belirleyin ve ölçülen ışık gücünü belirlenen aydınlatılmış alana bölün.
- Yüksek klorürlü hücre dışı çözelti için protokolü kaydedin. Protokolü değiştirin ve ilk seviye tutma potansiyelini -92.6 mV (düşük harici klorür) ile değiştirin. Düşük klorür hücre dışı durumunu ölçmek için bu ikinci protokolü kaydedin.
- Uyarlanmış protokole göre cam lamellerin lizin kaplaması.
- Bir cam petri kabına birkaç 100 kapak fişi yerleştirin ve 250 mL HCl (1 N) ekleyin.
- Petri kabını kapak kızaklarıyla birlikte doğrusal bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Lamelleri temizlemek için 120 rpm'de 72 saat çalkalayın ve ardından pH'ı nötralize etmek için ultra saf su ile durulayın.
- Daha fazla temizlik için bunları küçük bir hacimde% 95 etanol içinde bekletin.
NOT: Temiz kapak fişleri, devam etmeden önce %70 etanol içinde saklanabilir. Aşağıdaki adımlar için laminer akış başlığı altında çalışın.
- Bir Bunsen brülörü ve cımbız kullanarak, her bir lamel alevlendirin ve yeni bir petri kabına aktarın.
- Cam lamelleri steril bir 50 μg/mL poli-D-lizin çözeltisi ile oda sıcaklığında en az 1 saat (veya gece boyunca) inkübe ederken, 150 rpm'de doğrusal bir çalkalayıcı ile çalkalayın.
- Fazla poli-D-lizini çıkarmak için lamelleri ultra saf suyla yıkayın.
- Kapak fişlerini steril kağıda 10 dakika kuruması için yayın ve sterilizasyon için UV (Ultraviyole) ışığına maruz bırakın (en az 20 dakika).
- Lamelleri, kullanana kadar alüminyum folyo ile kaplı steril bir petri kabına toplayın.
- Standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak mCherry ile kaynaşmış PsACR1 geninin DNA'sını hazırlayın.
- PsACR1'i kodlayan insan kodonu optimize edilmiş gen dizisini, kısıtlama enzimleri veya diğer yerleşik klonlama yöntemlerini kullanarak mCherry florofor ile çerçeve içinde bir peGFP-C1 plazmidine (CMV (Sitomegalovirüs) promotor, kanamisin direnci) klonlayın.
Not: Diğer floroforlar da kullanılabilir, ancak kurulumda mikroskop altında floresanlarını gözlemlemek için ilgili filtre setlerinin hazır bulundurulduğundan emin olun.
- Plazmid DNA'yı standart protokole göre ısı şoku ile kemokompetan XL1Blue E. coli hücrelerine dönüştürün ve bunları agar plakalarına (30 μg/mL kanamisin) yerleştirin. Kaplanmış bakterileri gece boyunca 37 ° C'de büyütün.
- Ertesi gün, 30 μg/mL kanamisin ile takviye edilmiş 4 mL lizojeni et suyu ortamını tek kolonilerden hücrelerle aşılayın ve gece boyunca 37 ° C ve 180 rpm'de bir inkübatörde inkübe edin.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak plazmit DNA'sını kültürlerden saflaştırın.
- Hücreleri tohumlayın
NOT: Laminer akış başlığı altında adımları gerçekleştirin.
- 35 mm'lik bir petri kabına üç adede kadar lizin kaplı cam lameli yan yana yerleştirin.
not: Birbirlerinin üzerine kaymalarını önlemek için tabağın dibine hafifçe bastırın.
- 1.5 x 105 HEK (insan embriyonik böbrek hücreleri) hücrelerini, her tabakta %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 2 mL standart Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM)
tohumlayın.
- All-trans retinal'i 1 μM'lik bir final konsantrasyonunda destekleyin. Adım 1.6'ya geçmeden önce hücreleri en az bir gün büyütün.
- Hücreleri lipofeksiyon yoluyla geçici olarak transfekte eder.
- Her hücre tabağı için, FBS ve 6 μL transfeksiyon reaktifi olmadan 250 μL DMEM'de 2 μg plazmit DNA (Deoksiribonükleik asit) çözeltisi hazırlayın.
- 15 dakikalık inkübasyondan sonra, çözeltiyi yavaşça (damla damla) hücrelere ekleyin.
- Agar köprüleri hazırlayın
- 50 mL steril sodyum klorür çözeltisine (140 mM) 0.75 g agaroz ekleyin ve bir mikrodalgada ısıtarak çözün.
NOT: Agar köprüsü hazırlığı için 2 - 3 M KCl, daha yüksek konsantrasyon (örn. köprüden sürekli difüzyon) ve K+ ve Cl- iyonlarının eşit hareketliliği nedeniyle LJP'yi daha da azaltır, ancak iyon (özellikle Cl-) sızıntısını en aza indirmek için kaçınılmıştır.
- 10 μL pipet ucunu (veya küçük çaplı bir hortumu) bir şırınga kullanarak sıvı agaroz solüsyonu ile doldurun.
not: Köprüde hava kabarcıklarından kaçının.
- Agar köprüleri soğuduktan ve katılaştıktan sonra, bunları steril bir 140 mM sodyum klorür çözeltisinde saklayın.
- Kayıt ve banyo elektrotlarını hazırlayın.
- Gümüş telleri banyodan ve yama kelepçesi kurulumunun kayıt elektrodundan çıkarın.
- Önceki deneylerden gümüş klorürü çıkarmak için telleri zımpara kağıdı ile cilalayın. Temiz gümüş teli 3 M KCl'ye daldırın ve gümüş klorür ile elektrolitik kaplama için 1,5 V'luk bir pilin artı kutbuna bağlayın.
NOT: Pil yerine bir laboratuvar güç kaynağı kullanılabilir.
- Düşük dirençli yama pipetlerini (1.5-3.0 MΩ) bir mikropipet çekicisi ile cam kılcal damarlardan çekin ve ateşle parlatın. Pipetleri ölçüm günü boyunca tozsuz bir şekilde saklayın.
- Kayıtlardan 30 dakika önce çalışma sıcaklığına kadar ısıtmak için tüm kurulum bileşenlerini açın. Tamponların oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
2. Seçicilik Ölçümleri
- Hücrelerin geçici transfeksiyonundan 24 ila 48 saat sonra kayıtları başlatın.
- Ölçüm haznesine bir lamel yerleştirin ve harici tamponun sızmasını önlemek için silikonla kapatın. Bir sonraki deney seti için petri kabını diğer lamellerle birlikte bir kuluçka makinesinde saklayın.
- Hücre ayrılmasını önlemek için hazneyi hücre dışı tamponla (yüksek [Cl-]) dikkatlice doldurun, ardından mikroskobun altına yerleştirin ve hücreleri görselleştirmek için 40X objektifi kullanın.
- Banyo elektrodunun üzerine bir agar köprüsü yerleştirin ve sıvı seviye sensörü ve banyo işleyicisinin perfüzyon çıkışı ile birlikte hazneye yerleştirin.
- Artık kültür ortamını ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için hücre dışı çözeltiyi 1 mL taze harici çözelti (yüksek [Cl-]) ile iki kez değiştirin.
- Hücreleri odak noktasına getirin ve diğer hücrelerden izole edilmesi gereken transfekte edilmiş (floresan) bir hücre arayın. mCherry.
not: HEK hücreleri, boşluk bağlantıları ile komşularına elektriksel olarak bağlanabilir, bu da tüm hücre konfigürasyonunda düşük membran direncine neden olur.
- Çekilen pipetlerden birini hücre içi solüsyonla doldurun ve pipeti birkaç kez çevirerek hava kabarcıklarını çıkarın.
- Pipeti pipet tutucusuna monte edin ve ucun tıkanmasını önlemek için biraz pozitif basınç uygulayın.
- Mikroskop altında yama pipetinin ucunu bulun ve mikromanipülatörü kullanarak hücreye yakın bir şekilde gezinin.
not: Aşağıdaki adımlar, malzeme listesinde belirtilen amplifikatör, veri toplama ve değerlendirme yazılımı için geçerlidir.
- Veri toplama yazılımında "membran testini" başlatın ve bir voltaj adımı uygulayın (test darbesi; örn. 10 ms için 5 mV, 0 mV'de taban çizgisi), veri toplama yazılımında "membran testi" çalıştırılırken "banyo modu" kullanılarak belirtilen yazılım aracılığıyla manuel veya otomatik olarak.
- Pipet direncinin istenen aralıkta (1,5-3,0 MΩ) olduğunu kontrol edin.
- "Membran testinin" "banyo modunda" çalışırken amplifikatörde pipet ofset düğmesini çevirerek pipet potansiyelini ayarlayarak sıfır ofset akımı.
- Tüm hücre konfigürasyonunda bir yama oluşturun.
NOT: Aşağıdaki adımlar, kullanılmış pipet tutucunun yan bağlantı noktasına verilen pozitif ve negatif basıncın uygulanmasını gerektirir. Bu, bir şırınga kullanılarak, bir ağızlık veya elektronik olarak kontrol edilen bir basınç regülatörü aracılığıyla yapılabilir. Bu protokolde pozitif ve negatif basınç bir ağızlık aracılığıyla uygulanır.
- Yama pipeti ile hücreye üstten yavaşça yaklaşın ve dokunmadan hemen önce pozitif basıncı boşaltın.
NOT: Uç hücreye yakın olduğunda, direnç hafifçe yükselecektir; Bu, test darbesinin küçültülmüş bir boyutu ile gösterilir.
- "Membran testini" "banyo modundan" "yama moduna" değiştirin, böylece tutma potansiyelini hücrelerin beklenen dinlenme potansiyeline (-30 ila -40 mV) değiştirin.
- Bazı durumlarda, hücreye bağlı konfigürasyon, pozitif basıncın serbest bırakılmasından sonra kendini oluşturur. Değilse, gigaseal oluşumuna yardımcı olmak için hafifçe negatif basınç uygulayın.
not: Hücreye bağlı konfigürasyon, test darbesi, darbenin başında ve sonunda iki küçük kapasitif tepe noktasına düşürüldüğünde ve membran direnci GΩ aralığında olduğunda kurulur; -60 mV'a kadar negatif voltajlar gigaseal oluşumunu kolaylaştırabilir.
- Test darbesinin düz bir yanıtını almak için "pipet kapasitans telafisi" düğmelerini çevirerek pipet kapasitansını telafi edin.
- Tam hücre konformasyonu elde etmek için kısa negatif basınç darbeleri veya artan mukavemete sahip negatif basınç uygulayarak sızdırmazlığı tahrip etmeden yamayı yırtın.
not: Hücreye bağlı konfigürasyondan tüm hücre konfigürasyonuna başarılı geçiş, kapasitif tepe noktalarının artmasıyla gösterilir.
- Membran potansiyelinin istenen tutma voltajına doğru şekilde kenetlenmesi için kullanılan amplifikatörün tüm hücre parametresini ve kompanzasyon ayarlarını ayarlayarak seri direnç kompanzasyonu uygulayın.
- "Membran testini" "tüm hücre" moduna geçirin, "Seri direnç telafisi" panelinde, kapasitif yanıtın aşırıya kaçmasını ve salınımını önleyerek %90'a kadar "tahmin" ve "düzeltme" yi açın, tüm hücre kompanzasyonunu açın ve ideal bir performans elde etmek için amplifikatörün uygun ön panel düğmeleriyle ("tam hücre kapasitesi" ve "seri direnç") tüm hücre parametrelerini ayarlayın. Düz Test Contası Yanıtı.
not: Seri direnç kompanzasyonunun ve düzeltmesinin ayrıntılı açıklaması için, amplifikatör kılavuzuna veya kılavuzuna bakın, çünkü bu prosedür farklı üreticiler arasında farklılık gösterir.
- Tüm hücre konfigürasyonunu kurduktan sonra, yama pipetinden hücre içi çözeltinin yeterli şekilde değiştirilmesini sağlamak için kayıttan önce en az 2 dakika bekleyin.
- Daha önce ayarlanmış protokolleri kullanarak (1.2'de) farklı tutma potansiyellerinde ışık kaynaklı akımları kaydedin.
- Yamayı tahrip etmeden hücre dışı tamponu haznede en az beş kez düşük [Cl-] ile değiştirin ve yeni klorür konsantrasyonunda başka bir akım-voltaj ilişkisi (bkz. adım 1.2) kaydedin.
not: Otomatik tampon değişimi için bir perfüzyon sistemi bu işlemi kolaylaştırır ancak gerekli değildir.
- Test edilecek her iyonik koşul için 2.15'i tekrarlayın, ancak yukarıda açıklanan bir "membran testi" ile ölçümler arasındaki yamanın kalitesini tekrar tekrar kontrol edin.
not: Doğru membran voltajını ve kararlı hücre içi iyon bileşimini garanti etmek için membran direnci 500 MΩ'un üzerinde olmalı, erişim direnci ise 10 MΩ'u geçmemelidir, bkz. 2.12.6). Membran testi için tüm hücre parametre kompanzasyonunu kapatmayı unutmayın.
- Birkaç hücre için 2.2. ila 2.15 arasında tekrarlayın, ancak hücrelerin sağlıklı olduğundan emin olmak için her test serisi için yeni bir kapak fişi alın.
Tablo 1: Tamponlu Çözeltilerin İyonik Bileşimi. HEK hücrelerinde klorür seçicilik deneyleri için hücre içi (hücre içi) ve hücre dışı (ekstra.) tamponların bileşimi. Kullanılan kısaltmalar: etilen glikol tetraasetik asit (EGTA),4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve aspartat (ASP). Tüm konsantrasyonlar mM cinsindendir.
)
| ıntra. | Ekstra.1 | Ekstra.2 |
| yüksek klorür | düşük klorür | düşük klorür |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl (Doğal) | 110 | 140 | 0 |
| Kartal | 1 | 1 | 1 |
| CsCl (İngilizce | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 10 | 10 | 10 |
| EGTA (EGTA) | 10 | 0 | 0 |
| Ph | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| Osmolarite | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |