$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kayıt
>NOT: Bu prosedürde, izole gangliondan yama klemp kayıtları tipik olarak kaplamadan 12-24 saat sonra gerçekleştirilir. Diğer laboratuvarlar, kültürde çok daha uzun süreler geçirdikten sonra nöronlardan elde edilen sonuçları bildirmiştir.
- Kayıt odasını hazırlayın
- Doğrudan kültür kabında yama kelepçeli kayıtlara izin veren hızlı değişim kayıt odasını (veya eşdeğerini) kullanın. Odayı ters çevrilmiş mikroskop üzerine kurun.
- Cam tabanlı kültür kaplarını hazneye yerleştirin.
- L-15 çözeltisini bir perfüzyon tüpü sisteminden kayıt odasına besleyin. Odadaki perfüzyon giriş ve çıkışını dakikada 0.5-1 mL oranında stabilize edin.
- Elektrotları yüklemek için dahili çözeltiyi hazırlayın
- Delikli yama iç çözeltisinin bir kısmını çözün. 2.5 mL çözeltiyi 35 mm'lik bir kültür kabına tahsis edin. Kültür kabının kapağını değiştirin ve "Tip Dip" olarak etiketleyin. Tozsuz bir bölgede bir kenara koyun, çünkü bu çözeltiyi mümkün olduğunca temiz tutmak çok önemlidir.
- 1 mg amfoterisin-B tartın ve 20 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. Tüm amfoterisin-B çözeltinin içine girene kadar çözeltiyi girdaplayın ve döndürün. Çözülmüş delikli yama iç çözeltisinin kalan 2 mL'sine 10 μL DMSO / amfoterisin-B çözeltisi ekleyin. DMSO / amfoterisin-B'nin iç çözeltiye eşit şekilde karıştığından emin olmak için çözeltiyi iki veya üç kez bir pipetle geri çekin ve boşaltın. Çözelti hafif sarımsı bir renk tonuna sahip olacaktır.
- Amfoterisin-B delikli yama iç çözeltisini 3 mL'lik bir şırıngaya çekin. Şırıngaya 34 G'lik bir uç ekleyin. Şırıngayı alüminyum folyoya sarın ve şırıngayı buz üzerinde tutun.
not: Amfoterisin-B'nin hücre zarını delmedeki etkinliğini sağlamak için bu çözelti her 2 saatte bir yeniden yapılmalıdır. Amfoterisin-B ışığa duyarlıdır ve alüminyum folyo veya diğer yöntemler kullanılarak ışıktan korunmalıdır.
- Yama kelepçesi kayıtları
- 10x veya 20x objektif kullanarak nöronları görselleştirin. Hücrenin etrafındaki sınırları ve gölgeleri görmek için aydınlatmayı ayarlayın ve optiği optimize edin.
- İzole edilmiş nöronların kalitesini kontrol edin. Yalnızca çok güçlü bir kontrast oluşturmayan ve sadece küçük, dağınık kraterlere sahip pürüzsüz ve düz yüzeylere sahip nöronları deneyin. Ayrıca, nöron çiftlerinden, enkazla çevrili nöronlardan veya diğer hücrelerden kaçındığınızdan emin olun.
- 100x büyütme altında, yama yapmak için bir nöron veya nöron alanı belirleyin ve bunları görüş alanının merkezinde hizalayın.
- Pipetin ucunu amfoterisin içermeyen temiz bir solüsyonla doldurun ve ucu (~20 s) bir kültür kabına yerleştirilmiş temiz solüsyona batırın. Kılcal hareket, uca az miktarda çözelti çekecektir.
not: Bu adımı, ucun Tip Daldırma solüsyonunu ne kadar iyi tuttuğunu belirlemeye izin veren bir stereo diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin. Çözelti ~ 10-20 s boyunca tutmazsa, elektrotun şekli ideal değildir. Bu durumda, daha uzun bir uç elde etmek için elektrot çekme programını yeniden yapılandırın.
- Ardından, pipetin arkasını amfoterisin içeren iç solüsyonla doldurun. Pipet içindeki filament, uçtaki temiz çözeltiyi karşılamak için çözeltiyi aşağı çekecektir. Filamentin çözeltiyi düzgün bir şekilde aşağı çekmesine izin verin ve amfoterisini uca çok hızlı zorlayacağından kabarcıkları dışarı atmaya çalışmayın.
- Elektrotun en arkasında olabilecek çözeltiyi çıkarmak için bir şırınga kullanın.
not: Bu noktadan karaya kadar hızlı çalışmak ve istenilen hücre üzerinde yüksek dirençli bir conta oluşturmak çok önemlidir.
- Pipeti pipet tutucusuna yerleştirin. Pipetin kaymasını önlemek için pipetin tutucuya tam oturduğunu kontrol edin. Pipet sabit değilse, kaymayı en aza indirmek ve güçlü emişi sürdürmek için pipet tutucunun önündeki ve arkasındaki sızdırmazlık O-ringlerini değiştirin. Pipeti yeni doldurulmuş bir pipetle değiştirin.
- Pipeti kayıt odasının banyosuna indirin.
- Görüş alanının ortasındaki pipet ucunu bulun. Ucunda hava kabarcıkları veya diğer kalıntılar olmadığından emin olun.
- Pipet direncini izlemek için membran testinde bir voltaj adımı (5 mV) uygulayın. Hücre üzerinde bir conta oluşturma sürecinin tamamı boyunca giriş direncini izlemeye devam edin.
- pClamp'in membran test modunda pipet akımı sıfır olacak şekilde pipet ofset potansiyelini iptal edin.
- Yama kelepçesi amplifikatöründeki hızlı kapasitans dengeleme işlevini kullanarak pipet kapasitansını düzeltin (Multiclamp Commander yumuşak panelindeki Cp hızlı aramalar).
- Pipeti hücreye doğru hareket ettirin.
- Pipet nörona yeterince yaklaştığında, daha yüksek büyütme hedefine geçin ve görüntüyü bir kamera aracılığıyla bir monitöre gönderin (40x objektif, toplam 400x büyütme kullanın). Pipeti ayarlayın ve nöronu yeniden ortalayın.
- Kayıt elektrodunu somaya yaklaştırın. Monitörde nöronun merkezini bulun ve kayıt elektrodunu nöronun üzerine yerleştirin.
- Nörona yukarıdan yaklaşın, böylece elektrot küresel hücrenin merkezine inecektir. Pipet ofsetini, sistemdeki sabit DC potansiyellerini sıfırlayacak şekilde ayarlayın.
- Pipeti membrana yakın bir yere yerleştirin. Hücrenin ortasına sıkıca inin.
not: İniş sırasında, nöronun yüzeyinde küçük bir çukurlaşma ve giriş direncinin iki katına/üç katına çıkması meydana gelecektir.
- Bir şırınga veya ağız pipeti kullanarak negatif basınç (emme) uygulayın. -60 mV'luk tutma potansiyelini açın. Sızdırmazlık direnci, bir giga-ohm.
geçene kadar artmalıdır.
not: Bir elektrotun doldurulması ile bir hücreye iniş arasındaki süreyi azaltmak için hızlı çalışın. Delikli yama iç çözeltisine eklenen amfoterisinin elektrot ucuna ulaşması için sınırlı bir süre vardır. Uç amfoterisin ile kontamine olduktan sonra, yüksek dirençli contalar oluşturmak zordur ve direnç genellikle ~ 200 megaohm'a kadar plato yapar.
- Giga-ohm'luk bir conta oluştuğunda, negatif basıncı serbest bırakın. Sızdırmazlık oluşur oluşmaz, membran test modunda pipet kapasitans geçici akımlarının genliğini mümkün olduğunca azaltmak için hızlı kapasitans kompanzasyonu uygulayın.
- Amfoterisin çalışmaya başladığında, giriş direncinin yavaş yavaş azaldığını ve amfoterisin zara girdikçe 5 mV voltaj adımına yanıt olarak akan akımın kademeli olarak arttığını izleyin. Kademeli stabilizasyon yerine seri dirençte ani bir azalma, kendiliğinden yırtılmanın meydana geldiğini gösterir.
- Amplifikatörün kapasitif geçici nulling fonksiyonunu kullanarak tüm hücre kapasitansını ve seri direnci tahmin edin. Deneyin başında ve sırasında düzenli olarak seri direnci belgeleyin ve izleyin.
not: Seri direncin, elektrotun boyutuna ve pipete ne kadar temiz çözelti çekildiğine bağlı olarak stabilize olması 5-20 dakika arasında sürebilir. Voltaj-kelepçe ve akım-kelepçe modları, seri direnç 30 megaohm'un altına sabitlendiğinde kullanılabilir. Kayıt sırasında nöronların şişmesi veya küçülmesi bazen gözlenir, ancak nadiren çözeltilerin ozmolaritesi ve pH'ı doğru şekilde ayarlandığında gözlenir.