Akut Beyin Dilimlerinde Nöronal Bağlantıların Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kaydı

Özet

Kaynak: Qi, G., et al. Eşleştirilmiş yama-kelepçe kayıtları kullanılarak akut beyin dilimlerindeki nöronal mikro devrelerin elektrofizyolojik ve morfolojik karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, bir beyin dilimini sabitleyerek, pipetleri tüm hücre konfigürasyonlarını elde etmek için konumlandırarak ve postsinaptik yanıtları kaydetmek için presinaptik nöronları uyararak sinaptik bağlantıları haritalama prosedürünü gösterir, böylece nöronal bağlantıyı aydınlatır.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Eşleştirilmiş Yama-Kelepçe Kaydı ve Biyosit Dolgusu

Sinaptik bağlantının türüne bağlı olarak, sinaptik olarak eşleşmiş nöronları bulmak için üç farklı yaklaşım kullanılır. Bağlantı olasılığı düşükse (çoğu uyarıcı bağlantı için beklenebileceği gibi), aşağıdakileri yapın:

1. Düşük bağlantıya sahip nöronal bağlantılar
   1. Yama pipetlerini Tablo 1'de listelenen bileşimin dahili bir çözeltisiyle doldurun. Tüm hücre konfigürasyonundaki tüm kayıtlar için, pre- ve postsinaptik nöronlar için iyi boyama sonuçları elde etmek için dahili (pipet) çözeltiye 3-5 mg / ml arasındaki konsantrasyonlarda biyosit ekleyin. Biyositinin hücre içine en az 15-30 dakika yayılmasına izin verin (nöronun boyutuna bağlı olarak).
      NOT: Aşağıda belirtilen 'arama' pipetlerinde kullanılan çözeltiye biyosit eklemeyin.
   2. Tüm hücre modunda varsayılan bir postsinaptik nöronu yamalayın. Uzun ve ince saplı yama pipetleri kullanın. Bu, pipetin objektif altındaki manevra kabiliyetini kolaylaştırır ve elektrot dilime sokulduğunda oluşabilecek hareket artefaktlarını azaltır.
   3. Daha sonra, 8 - 10 MΩ dirençli ve küçük bir uç çapına sahip bir 'arama' yama pipeti kullanarak hücreye bağlı bir konfigürasyonda potansiyel bir presinaptik nöronu yamalayın. Bu pipetler hücreye bağlı 'gevşek' bir yama oluşturur. Presinaptik bir hücre ararken nöronların depolarize olmasını önlemek için 'arama' pipetini K⁺'nın Na⁺ ile değiştirildiği dahili bir solüsyonla doldurun (Tablo 2).
      NOT: 'Gevşek' sızdırmazlık direnci GΩ aralığında değil, tipik olarak 30 - 300 MΩ civarındadır.
   4. Mevcut kelepçe modunda 'gevşek' conta altındaki membran potansiyelini yaklaşık -30 ila -60 mV'a tutun. Ardından, potansiyel presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için büyük akım darbeleri (0.2 - 2 nA) uygulayın. Bu aksiyon potansiyelini voltaj tepkisi üzerinde küçük bir spikelet olarak gözlemleyin.
   5. Postsinaptik yanıtın tükenmesini önlemek için stimülasyon frekansını 0.1 Hz'e ayarlayın. Beyin dokusu çok olgunlaşmamışsa veya sinaptik bağlantı çok güvenilir değilse daha düşük stimülasyon frekansları kullanın.
   6. 'Postsinaptik' nöronun, test edilen 'presinaptik' nöronun uyarılmasına yanıt vermemesi durumunda, 'gevşek' sızdırmazlık modunda yeni bir nöron yamalayın. >30 MΩ'luk bir dirence sahip conta oluştuğu sürece 'arama' yama elektrodunu değiştirmeyin. Bu şekilde, 30'a kadar potansiyel olarak presinaptik nöronu test edin.
      not: Arama prosedürü sırasında gevşek bir yama kelepçesi ile nörona zarar vermemek için, tüm hücre yama pipetine uygulanana kıyasla arama pipetine yalnızca hafif bir emme uygulanmalıdır.
   7. 'Gevşek' sızdırmazlık modunda stimülasyon, postsinaptik nöronda <5 msn gecikme süresine sahip bir EPSP / IPSP (uyarıcı postsinaptik potansiyel / inhibitör postsinaptik potansiyel) ile sonuçlanırsa, presinaptik nörondan 'arama' pipetini çıkarın.
   8. 'Arama' yama pipetini biyosit içeren, normal dahili solüsyonla doldurulmuş bir yama elektrotu ile değiştirin. Bu kayıt yaması pipetinin 4 - 8 MΩ dirence sahip olduğundan emin olun; SOMA boyutu ne kadar büyük olursa, elektrot direnci o kadar düşük olabilir.
   9. Presinaptik nöronu yamalayın ve tüm hücre, akım kelepçesi modunda kaydedin. Presinaptik nöronlarda akım enjeksiyonu ile aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarın ve postsinaptik yanıtı kaydedin. Verileri daha sonra çevrimdışı analiz etmek için bir bilgisayarda depolayın.

Tablo 1. Düşük klorürlü pipet çözeltisi.

adet adet adet adet )

	Mm	g/L	g/50 ml
K-glukonat	135	31.622	1,5811
Kartal	4	0,298	0,0149
HEPES ÜNİVERSİTESİ	10	2.384	0.1192
Fosfokreatin	10	2.552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0,1014
GTP-Na (GTP-Na	0,3	0,156	0,0078
KOH ile pH'ı 7.3'e ayarlayın
Ozmolarite ~300 mOsmol/L
3 - 5 mg / ml biyosit ekleyin

Tablo 2. Sinaptik olarak eşleşmiş nöronları aramak için yüksek Na pipet çözeltisi.

adet adet adet )

	Mm	g/L	g/50 ml
Na-glukonat	105	22,92	1.146
NaCl (Doğal)	30	1,76	0,088
HEPES ÜNİVERSİTESİ	10	2.384	0.1192
Fosfokreatin	10	2.552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0,1014
GTP-Na (GTP-Na	0,3	0,156	0,0078
NaOH ile pH'ı 7.3'e ayarlayın
Ozmolarite ~300 mOsmol/L

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
yükselteç	HEKA (Türkçe	EPC 10 USB Üçlü	2-3 ön amplifikatör ile
mikroskop	Olympus	BX51WI	2 kamera bağlantı noktası ve 4 × objektif, 40 × suya daldırma objektifi ile
kamera	FOTONİK KADAR	VX55	kızılötesi CCD kamera
workstation	Luigs ve Neumann	Altyapı 240	Mikroskop için motorlu bir XY aşaması ve motorlu bir odak ekseni ile
Mikromanipülatör	Luigs ve Neumann	SM-5	2-3 ön yükseltici için XYZ manipülatörleri
Faraday kafesi	Luigs ve Neumann
Titreşim önleyici masa	Newport Spektrumları-Fizik
Yama Ustası	HEKA (Türkçe
Mikrotom	Microm Uluslararası	HM650V
Mikropipet çektirme	HEKA (Türkçe	Sutter P-97
Neurolucida sistemi	Mikro parlak alan		Neurolucida ve Neuroexplorer yazılımları ile

) Serisi Serisi ) Serisi )