Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Yama Kelepçesi Kayıtları
- Bozulmayı önlemek için elektrot çözeltisini (bkz. Tablo 1) buzun üzerine yerleştirin. Cam yama pipetini filtrelenmiş hücre içi solüsyonla (şırınga filtresi, gözenek boyutu: 0,2 μm) doldurun ve pipeti baş aşaması pipet tutucusuna yerleştirin. Pipeti banyo solüsyonuna indirmeden önce pistonu yaklaşık 1 ml yer değiştirerek 5 ml'lik bir şırınga aracılığıyla pipete nazik, pozitif basınç uygulayın.
Not: Bu, pipetin tıkanmasını önler.
- Amplifikatör üzerindeki mod düğmesini çevirerek "V-clamp" modunu seçin, ardından yazılımdaki "Membran testi" arayüzünü açın. Pipeti mikroskop incelemesi altında hedef nörona yaklaştırın.
not: Bozulmamış DRG preparatında, ince bir uydu glial hücre tabakası her nöronu kapsar.
- Nöron ile çevresindeki uydu glial hücre tabakası arasında ani bir boşluk genişlemesi gözlenene kadar uydu glial hücre katmanını geçmek için pipetten gelen pozitif basıncı kullanın. Nöron üzerinde bir "çukur" görülene kadar pipeti nörona doğru hareket ettirmeye devam edin.
not: İlişkisiz nöronlardan gelen kayıtlarla karşılaştırıldığında, pozitif basıncın biraz daha büyük olması gerekir, bu da uydu glial hücre tabakasına nüfuz etmeye ve başarılı yama şansını artırmaya yardımcı olacaktır.
- Pozitif basıncı azaltın. Ardından, nazik emiş ile bir giga ohm sızdırmazlık elde edin.
not: Bu yöntemle kayıt başarı oranı en az %70'tir.
- Daha önce açıklandığı gibi tam hücre kayıt yapılandırmasını edinin.
- Kısa ama güçlü bir emme yoluyla nöron hücre zarına kısaca nüfuz edin. Alternatif olarak, emme uygulanırken amplifikatörün "zap" işlevini kullanın.
- Bir tam hücre modu kurulduktan sonra, amplifikatör üzerindeki kapasitans ve direnç kompanzasyon düğmelerini çevirerek tüm hücre kapasitansını ve seri direnci (Rs) telafi edin.
not: Rs normalde 5-20 MΩ'dur.
- Rs başlangıçta 30 MΩ'dan büyükse veya kayıt sırasında% 20'den fazla değişirse hücreyi terk edin. Ayrıca, dinlenme zarı potansiyelini ölçün; -50 mV'den fazla ise bir hücreyi terk edin.
- "Membran testi" penceresini kapatın. Amplifikatör üzerindeki mod düğmesini çevirerek "I-clamp normal" modunu seçin.
- Yazılımda "protokolü aç"a tıklayın, reobaz ölçümü için protokolü seçin ve yükleyin. Kayda başlamak için "kaydet" i tıklayın. 100 pA'lık adımlarla kademeli bir dizi depolarize edici akım enjekte ederek nöronal uyarılabilirliği incelemek için giriş direncini ve reobazı ölçün.
- Yazılımda "protokolü aç"a tıklayın, reobaz ölçümü için protokolü seçin ve yükleyin. Kayda başlamak için "kaydet" i tıklayın. 100 pA'lık adımlarla kademeli bir dizi depolarize edici akım enjekte ederek nöronal uyarılabilirliği incelemek için giriş direncini ve reobazı ölçün.
- Kaydedilen izleri üreticinin talimatlarına göre analiz etmek için veri toplama ve analiz yazılımı (örn. Clampfit) kullanın. Yazılım, iletilen hiperpolarize edici akımlar sırasında kararlı durum I-V ilişkisine dayalı olarak giriş direncini (Rin) hesaplar. Reobaz ve membran eşiği değerini ölçmek için imleci hareket ettirin. not: AP'yi indüklemek için gereken akımın genliği reobaz olarak tanımlanır ve AP'yi indüklemek için en düşük voltaj membran eşiği olarak tanımlanır.
- Ligand kaynaklı akımları kaydedin.
- Bir pipeti belirli agonistlerle doldurun.
Not: Mevcut raporda, glutamat reseptörleri ve TRPA1 reseptörlerinin aracılık ettiği akımları indüklemek için sırasıyla 100 μM glutamat ve 100 μM AITC kullandık.
- İçinde hava kabarcığı olmadığından emin olmak için pipeti kontrol edin. Pipeti pipet tutucusuna yerleştirin. Pipet tutucuyu bir ilaç dağıtım sistemine bağlı bir tüpe bağlayın.
- Pipeti nöronun 50 μm yakınına hareket ettirmek için manipülatörü kullanın. İlaç dağıtım sistemi basıncını 1 psi'ye ve süreyi 1 saniyeye ayarlayın. Kayıt modunu voltaj kelepçesine getirin ve -70 mV'de kelepçeleyin. İlacın neden olduğu bir akımı kaydetmek için ilaç dağıtım sistemi aracılığıyla basıncı kısaca uygulayın.
Tablo 1
| 100 ml hücre içi çözelti |
| Konsantrasyon (mM) | parça | Mw | G |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | Kartal | 74,55 | |
| 10 | HEPES ÜNİVERSİTESİ | 238,3 | |
| 10 | EGTA (EGTA) | | |
| 2 | MgCl2 * 6H2O | 203.3 | |
| Notlar: KOH ile pH'ı 7.4'e ve sükroz ve damıtılmış su ile ozmolariteyi 260 - 280 mOsm'ye ayarlayın. Hemen kullanmadan önce 2 mM MgATP, 0.5 mM Na2GTP ekleyin ve filtreleyin. |
