Fare Kokleasının Belirli Frekans Bölgelerinde Şerit Sinapslarının Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Yu, S., et al. Fare Kokleasının Belirli Frekans Bölgelerinde Şerit Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, fare kokleasının belirli bölgelerindeki şerit sinapslarını değerlendirmek için bir yöntem gösterilmektedir. Her koklear dönüşte farklı frekans bölgelerindeki fonksiyonel sinapsları tanımlamak için immün boyama ve konfokal görüntüleme tekniklerini kullanır.

Protokol

Hayvanların işlenmesiyle ilgili tüm prosedürler, enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan Seçimi

1. Tüm deneyler için, hayvan modeli olarak yetişkin C57BL / 6J erkek fareleri (8 haftalık) kullanın.
   NOT: Cdh23'ün ek varyantını taşıyan C57BL/6J fareler, işitsel sistemde hızlandırılmış yaşlanma sergiler, bu da kokleanın bazal dönüşünde %40'lık bir şerit sinaps kaybı ve 6 aylıkken orta dönüşte %10'luk bir kayıp olarak yansır, ardından yaşla birlikte tüm kokleada bu kaybın hızlı bir şekilde artması. Bu nedenle, işitsel araştırma için 6 aydan büyük C57BL/6J fareleri kullanırken dikkatli olmanızı öneririz. Diğer fare türleri, belirli deneysel amaçlara bağlı olarak kullanılabilir.
2. İşitme değerlendirmelerinden önce dış veya orta kulak patolojilerini ekarte etmek için fareleri profesyonel bir tanısal cep otoskopu kullanarak inceleyin. Potansiyel belirtiler arasında dış kulak yolunda sıvı veya irin, lokal dokuda kızarıklık ve şişlik ve timpanik membran perforasyonu sayılabilir.
   NOT: Bu durumla nadiren karşılaşılsa da, bir kez tanımlandıktan sonra, dış veya orta kulak hastalığı olan fareler dışlanmalıdır.

2. İşitme Değerlendirmesi

1. Ketamin hidroklorür (100 mg / kg) ve ksilazin hidroklorür (10 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu kullanılarak fareleri uyuşturun. Anestezinin derinliğini ağrılı uyaranlarla (örneğin, ayak parmağını sıkıştırma refleksi) değerlendirin.
   NOT: Ayak parmağını kıstırma refleksi tamamen olmadığında, hayvan işitsel test için yeterli anestezi derinliğine ulaşmıştır. Bilateral ABR (işitsel beyin sapı yanıtı) kayıtları için daha fazla zaman gerekiyorsa, orijinal anestezik düzlemi eski haline getirmek için daha düşük bir dozda (orijinal dozajın beşte biri) anestezik uygulayın. Farelerde ölüme yol açabileceğinden, anestezik aşırı dozdan kaçınmaya dikkat edin.
2. Anestezi uygulanmış hayvanın vücut sıcaklığını, termoregüle edici bir ısıtma yastığı kullanarak 37.5 °C'de tutun. İşitme testi boyunca paraziti önlemek için anestezi uygulanmış hayvanı elektriksel ve akustik olarak korumalı bir odaya yerleştirin.
   NOT: Anestezi sonrası hipoterminin neden olduğu ölümü önlemek için hayvan tamamen uyanana kadar tüm prosedür boyunca fizyolojik sıcaklığı koruyun.
3. Subdermal iğne elektrotlarını (20 mm, 28 G) kafatasının tepe noktasına (kayıt elektrodu), ölçülen kulağın kulak kepçesinin altındaki ipsilateral parotis bölgesine (referans elektrodu) ve kontralateral parotis bölgesine (toprak elektrodu), sırasıyla fare kafasının derisinin altında 3 mm derinliğe sahip yerleştirin.
4. Koni şeklinde uçlu 2 cm'lik plastik bir tüp aracılığıyla akustik stimülasyon gerçekleştirmek için kapalı alan hoparlörü kullanın. Ucu dış kulak kanalına yerleştirin.
   NOT: Kayıt ve referans elektrotlarındaki elektrik empedansının 3 kOhm'dan (genellikle 1 kOhm) az olduğundan emin olun. Empedans yüksekse, elektrotun yerleştirme yerini değiştirin, elektrodu alkolle temizleyin veya ABR dalga genliğindeki değişiklikleri önlemek için elektrodu değiştirin.
5. ABR kaydı için ton pipleri (3 ms süre, 1 ms yükselme/düşme süreleri, 21,1/sn hızında, frekans: 4–48 kHz) oluşturun ve bunları 5\u201210 dB SPL adımlarında 90'dan 10 dB'ye düşen ses basıncı seviyelerinde (SPL'ler) sunun. Bu adım sırasında, yanıtlar yükseltilir (10.000 kez), filtrelenir (0.1–3 kHz) ve ortalaması alınır (1.024 örnek/uyaran seviyesi).
   NOT: ABR'ler, her uyaran seviyesi için 10 dB'lik adımlarla toplanır ve eşiğe yakın ek 5 dB'lik adımlarla toplanır.
6. Her frekansta, minimum SPL'yi ifade eden ABR eşiğini belirleyin, bu da görsel inceleme ile açıkça tanımlanabilen bir veya daha fazla ayırt edilebilir dalga ile güvenilir bir ABR kaydı ile sonuçlanır.
   NOT: Dalga formlarının tutarlılığını sağlamak için genellikle eşik etrafındaki düşük SPL'ler için işlemi tekrarlamak gerekir. Tepki eşiği, 5 dB'lik bir azalmanın dalga formunun kaybolmasına yol açacağı durumlarda dalga formunun gözlemlenebileceği en düşük uyaran seviyesidir.

3. Koklear Doku İşleme

1. ABR kaydından sonra, anestezi uygulanmış fareleri servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın, başlarını ayırın, bülleri ventral taraftan açığa çıkarın ve kokleaya erişmek için keskin bir makasla açın.
2. İnce forseps kullanarak temporal kemikleri çıkarın, stapes arterini kesin, stapesleri oval pencereden çıkarın ve yuvarlak pencere zarını yırtın. Bir iğnenin ucunu (13 mm, 27 G) hafifçe döndürerek kokleanın tepesinde küçük bir delik açın.
3. İzole edilen kemikleri %4 (ağırlıkça/hacim) paraformaldehit ile gece boyunca 4 °C'de 0,1 M fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) içinde sabitleyin. İnce uçlu bir pipet kullanarak, oval veya yuvarlak pencerelere (giriş olarak) ve tepedeki açıklığa (çıkış olarak) uygulayarak sabitleyiciyi perilenfatik boşluklardan nazikçe yıkayın.
   NOT: Bazı proteinler, immüno-etiketleme için epitoplarının tahrip olmasını önlemek için kısa bir fiksasyon süresi gerektirir. Bu gibi durumlarda, üreticinin immünohistokimya talimatlarına bağlı olarak, kemikleri oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde inkübe edin. Fiksasyon, koklear kanı çıkarmak için kardiyak perfüzyon yoluyla da gerçekleştirilebilir, özellikle koklear sinaptopatinin fare modellerinde, daha sonraki aşamalarda spesifik olmayan lekelenme nedeniyle arka plan gürültüsünü önler.
4. Artık paraformaldehiti çıkarmak için kemikleri 0,1 M soğuk PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın. Kemikleri %10 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile RT'de 4 saat veya 4 °C'de 24 saat boyunca 20 rpm'de yatay bir çalkalayıcıda hafifçe çalkalayarak kireçten arındırın. EDTA yarıda yenilenebilir.
   NOT: Dekalsifikasyon süreleri, EDTA'nın konsantrasyonuna ve kullanıcıların tercihlerine bağlıdır. Dekalsifiye edilmiş doku, daha sonraki adımlarda izole koklear bütün bağlantıların manipülasyonunu kolaylaştıran belirli bir tokluk derecesini korumalıdır. Temporal kemikler rotasyon ile %10 EDTA'da kalsten arındırılabilir, bu da araştırmacıların ABR testleri ve fiksasyon deneylerini takiben laboratuvardan ayrılmalarına olanak tanır. Dekalsifikasyon süresi, 4 °C'de 20 ila 30 saat aralığında esnektir.
5. Dekalsifiye edilmiş bir temporal kemiği EDTA'dan 0.1 M PBS'ye aktarın. Apikal, orta ve bazal koklear bölgeleri sırayla incelemek için # 3 ve # 5 Dumont forseps ve 27 G iğnesini kullanın ve ardından kokleayı stereo diseksiyon mikroskobu altında kemikten çıkarın. Bir tıraş bıçağı kullanarak spiral bağ boyunca bir dizi küçük kesi yapın ve tektoryal zarı ve Reissner zarını çıkarın (Şekil 1).
   NOT: Diseke edilen koklea sağlam olduğu sürece, bu işlem operatörün olağan protokolüne göre değiştirilebilir.
6. Spiral limbus da dahil olmak üzere kalan işitsel epiteli, tam montaj hazırlıkları için ayrı koklear dönüşlere (apeks, orta ve kanca bölgeli taban) daha fazla inceleyin.
7. Bir ışık mikroskobunun 40x yağ hedefi altında, göz merceğine yerleştirilen 250 μm'lik bir ölçek ile baziler membran uzunluğunu ölçün, bu da IHC'lerin stereosiliaları boyunca ayarlanabilir.
8. Tüm segment uzunluklarını (segment başına 250 μm) toplayarak her bir koklear dönüşün uzunluğunu hesaplayın ve aynı zamanda her bir dönüşün uzunluklarını toplayarak baziler membranın toplam uzunluğunu elde edin.
9. Kanca bölgesi de dahil olmak üzere baziler membranın toplam uzunluğunu, koklear apeksten uzaklığa dayalı bir yüzdeye dönüştürün (%0 koklear apeksi, %100 koklear tabanı ifade eder).
10. Bu mesafeyi logaritmik bir fonksiyon kullanarak koklear karakteristik frekansa dönüştürün (d(%) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f), 1.25 mm/oktav frekans eğimi ile, burada d koklear apeksten yüzde olarak normalleştirilmiş mesafedir, f kHz cinsinden frekanstır), daha önce açıklandığı gibi. Böylece, her koklear dönüşte baziler membranın karşılık gelen bir alanındaki frekans aralığı elde edilebilir.

4. İmmünofloresan Boyama

1. Diseksiyondan sonra, her bir koklear dönüşü ayrı bir 2,5 mL'lik santrifüj tüpüne yerleştirin ve koklear dönüşleri bir döndürücü üzerinde RT'de 1 saat boyunca %10 keçi serumu/PBS/%0,1 Triton X-100 içinde inkübe edin.
2. Bir diseksiyon mikroskobu altında 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yukarıdaki blokaj/geçirgenleştirme solüsyonunu her tüpten çıkarın ve numuneleri% 5 keçi serumu / PBS /% 0.1 Triton X-100 içinde seyreltilmiş primer antikorlarla bir rotator üzerinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Koklear sinaptik şeritlerin immünokinokizasyonu için, presinaptik işaretleyici fare anti-karboksil terminal bağlayıcı protein 2 IgG1 (CtBP2, RIBEYE iskele proteininin B alanını etiketleme, 1:400) ve postsinaptik işaretleyici fare anti-glutamat reseptörü 2 IgG2a (GluR2, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit veya AMPA reseptörünün bir alt birimini etiketler, 1:200).
3. Kalıntı primer antikorları çıkarmak için 0.1 M soğuk PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın ve numuneleri% 5 keçi serumu / PBS /% 0.1 Triton X-100 içinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla RT'de 2\u20123 saat karanlıkta bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
   NOT: Adım 4.2'de kullanılan birincil antikorları tamamlayıcı olan keçi anti-fare Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) ve keçi anti-fare Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500) kullanarak uygun ikincil antikor karışımları hazırlayın. Sinaptik ribonlar için etiketleme verimliliğini artırmak için, spesifik ikincil antikorların seçilmesini öneririz. Bazı laboratuvarlar, GluR2 immün etiketlemesini artırmak için ikincil antikorlarla inkübasyonu uzatır.
4. Artık ikincil antikorları çıkarmak için 0.1 M PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın ve örnekleri 2.5 mL santrifüj tüplerinden 0.1 M PBS içeren 35 mm plakalara aktarın.
5. Slaytın üzerine 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir damla montaj ortamı yerleştirin ve numuneleri PBS'den montaj ortamına aktarın. Lamelin bir kenarını sürgünün üzerine yerleştirin ve lamellerin yavaşça düşmesini sağlamak için bırakın.
   NOT: Tüy hücrelerinin yukarı baktığından ve işlem sırasında koklear örneklerde katlanma veya bükülme olmadığından emin olmak için, koklear örnekleri stereo diseksiyon mikroskobu altında monte edin.
6. Slaytların kurumasını sağlamak için slaytları gece boyunca 4 °C'de bir slayt kutusuna yerleştirin ve ardından lazer konfokal mikroskop altında görüntüleyin.

5. Koklear Ribbon Sinapslarının Morfolojik Değerlendirmesi

1. DAPI'yi uyarmak için 405 nm UV diyot, 488 nm argon lazer ve 561 nm diyot pompalı katı hal (DPSS) lazeri olmak üzere üç lazerli bir konfokal mikroskop kullanarak görüntü slaytları (Uyarma spektrumu 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (Uyarma spektrumu 496–549 nm) ve Alexa Fluor 568 (Uyarma spektrumu 573–631 nm), sırasıyla.
2. 63x yüksek çözünürlüklü yağa daldırma lensi kullanarak her koklear dönüşten 8 μm'lik bir mesafe boyunca konfokal z yığınları elde edin.
   NOT: Bir kez tanımlandıktan sonra, fotomikrografları sayısallaştırmak için tüm parametreler kaydedilmeli ve tüm slaytlara aynı şekilde uygulanmalıdır.
3. Sinaptik punktum sayıları için, z-yığınlarını (0,3 μm adım boyutu) iç tüy hücrelerinin (IHC'ler) tüm uzunluğunu kapsayacak şekilde ayarlayın, böylece tüm sinaptik punktaların görüntülenebilmesini sağlayın.
4. Z ekseni projeksiyonunu elde etmek için puncta içeren görüntüleri bir z yığınında birleştirin ve görüntü işleme yazılımına aktarın.
5. Her IHC için sinaptik punkta sayısını hesaplamak için belirli frekans bölgelerindeki her bir z-yığınındaki sinaptik toplam sayıları IHC sayısına (DAPI nükleer manuel sayımlarına eşit) bölün. Her bir spesifik frekans bölgesinde, 9-11 IHC içeren farklı mikroskobik alanların üç görüntüsündeki tüm sinaptik punktaların ortalamasını alın.
   1. Serbest seçimler düğmesini kullanarak her bir IHC'nin bazolateral bölgeleri de dahil olmak üzere ilgi alanlarını (ROI'ler) ana hatlarıyla belirtin. Punkta'nın otomatik olarak ölçülmesi için ölçüm fonksiyonunu ve yakın bitişik noktalar arasında ayrım yapmak için havza fonksiyonunu kullanın.
   2. Her otomatik sayımdan sonra, puncta sayımının güvenilir olduğundan emin olmak için manuel düzeltmelerle görsel incelemeler yapın.
      NOT: Deneyciler, kaymanın kokleanın tepesinden mi, ortasından mı yoksa bazal dönüşünden mi olduğu konusunda kör kalmalıdır.
6. Hücre iskeleti mimarisini ve sinaptik lokalizasyonu daha iyi görselleştirmek için Kalem Aracı (M) ile bireysel IHC'leri komşularından manuel olarak izole etmek için sinaptik yapıyı ve dağılımı görsel olarak değerlendirin.
7. Presinaptik şeritlerin (CtBP2) ve postsinaptik reseptör yamalarının (GluR2) yan yana gelmesini incelemek için, Dikdörtgen Seçim Çerçevesi Aracı ile şeridin etrafındaki voksel boşluğunu çıkarın ve tek tek şeridi Kırpma ile izole edin. Görüntü > Görüntü Boyutu'na tıklayarak, bu minyatür projeksiyonların bir küçük resim dizisini edinin, bu daha sonra eşleştirilmiş sinapsları (yakından yan yana CtBP2-pozitif ve GluR2-pozitif punkta çiftleri olarak göründü) ve yetim şeritleri (postsinaptik glutamat reseptör yamaları eksik) tanımlamak için kullanılabilir (Şekil 2).
   NOT: Normal koklear sinapslar, tüy hücresi içindeki presinaptik şeridin (anti-CtBP2) ve işitme siniri terminalindeki postsinaptik glutamat reseptör yamasının (anti-GluR2) kombine immüno-etiketlemesi olarak ortaya çıkar. Bazı laboratuvarlar, sinaptik yama boyutunu veya hacmini ölçmek için 3D modelleme ile birlikte konfokal projeksiyonlar kullanır. Şerit sinapslarının önemli kaybından önce, boyutta değişiklikler gösteren veya eşleştirilmiş glutamat reseptör yamaları olmayan şeritler muhtemelen sinaptik disfonksiyonun göstergesidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Farelerde koklear frekans lokalizasyonu. (A) Stereo diseksiyon mikroskobu altında temporal kemikten diseke edilen tam eksplante kokleanın temsili bir görüntüsü. (B) Fare kokleası, koklear yan duvarın çıkarıldığı apikal, orta ve bazal dönüşlere bölünür. Koklear baziler membran fragmanları üzerindeki kırmızı daireler, kokleadaki frekans konumla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ketamin hidroklorür	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, Çin	H35020148	100 mg / kg
Ksilazin hidroklorür	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	X-1251	10 mg / kg
TDT fizyoloji cihazı	Tucker-Davis Teknolojileri, Alachua, FL, ABD	İşitsel Fizyoloji Sistemi III
SigGen/BioSig yazılımı	Tucker-Davis Teknolojileri, Alachua, FL, ABD	İşitsel Fizyoloji Sistemi III
Elektrikli Ped	Evcil Hayvan Eğlencesi	11072931136
Dumont forseps 3#	Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, B.C., Kanada	0203-3-PO
Dumont forseps 5#	Güzel Bilim Araçları, Kuzey Vancouver, B.C., Kanada	0209-5-PO
Stereo diseksiyon mikroskobu	Nikon Corp., Tokyo, Japonya	SMZ1270
Keçi serumu	ZSGB-BIO, Pekin, Çin	ZLI-9021
Anti-glutamat reseptörü 2, hücre dışı, klon 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, Amerika Birleşik Devletleri	MAB397	fare
Saflaştırılmış Fare Anti-CtBP2	BD Biyobilimler, Billerica, MA, ABD	612044	fare
Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG1antikoru	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	A21124 (İngilizce	keçi
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG2a antikoru	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	A21131 (İngilizce	keçi
DAPI içeren montaj ortamı	ZSGB-BIO, Pekin, Çin	ZLI-9557
Konfokal floresan mikroskobu	Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya	TCS SP8 II
Image Pro Plus yazılımı	Medya Sibernetiği, Bethesda, MD, ABD	Sürüm 6.0
Profesyonel teşhis cep otoskopu	Lude Tıbbi Cihaz ve Aletler Ticaret A.Ş., Ltd., Şangay, Çin	HS-OT10
İğne elektrodu	Dostluk Tıp Elektronik Co, Ltd, Xi'an, Çin	1029	20 mm, 28 G
Kapalı alan hoparlörü	Tucker-Davis Teknolojileri, Alachua, FL, ABD	CF1