Bir ko-kültürde glutamaterjik nöronlar ve glioma hücreleri etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Fuchs, Q. et al., Elektriksel Etkileşimleri Değerlendirmek için Glutamaterjik Nöronların ve Pediatrik Yüksek Dereceli Glioma Hücrelerinin Mikroakışkan Cihazlara Ko-kültürü. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, çok elektrotlu dizilere sahip bir mikroakışkan cihaz kullanılarak hiPSC'den türetilmiş kortikal glutamaterjik nöronların ve glioma hücrelerinin bir ko-kültüründe nöronal elektriksel aktivitenin değerlendirmesini göstermektedir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Ko-kültür protokolü

1. UW479 ve BT35 hücre hatları için tohumlama gününü ve konsantrasyonunu, glutamaterjik nöronlar için 21 günlük kültüre karşılık gelen, ko-kültürün başlaması gerektiğinde birleşik hücrelerin %80'ine ulaşacak şekilde ayarlayın.
2. Pediatrik yüksek dereceli gliomlar (pHGG) hücrelerini olgunlaşmış glutamaterjik nöronlar içeren mikroakışkan cihaza ekmeden önce UW479 ve BT35 hücrelerini tripsinize edin ve bunları her bir özel mikroakışkan cihazda (her hücre tipi için 900 hücre /^mm2 hedef yoğunluğa sahip) glutamaterjik nöronların üzerine tohumlayın.
3. Ko-kültürleri kontrollü bir ortamda (37 ° C,% 5 CO₂) glutamaterjik nöron Day11 ve daha sonraki ortam ile 2 gün boyunca Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
4. Canlılıklarını değerlendirmek için görüntü analiz yazılımı ile analiz edilen mikroskobik resimleri kullanarak pHGG hücrelerini sayın. Hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
   NOT: Aşağıdaki formülü kullanın: 100 - ((D23'teki hücre sayısı / D21'deki hücre sayısı) x 100).

2. Elektrofizyolojik kayıt

1. Elektrofizyolojik kaydı ticari bir sistem ve piyasada bulunan bir yazılımla gerçekleştirin.
   not: Deneyler, 100 μm aralıklı 30 μm çapında elektrotlardan oluşan bir çoklu elektrot dizisi (MEA) ile gerçekleştirildi.
2. pHGG hücrelerinin tohumlanmasından önce D21'deki glutamaterjik nöronlar üzerinde ilk elektrofizyolojik kaydı yapın. Farklılaşmış glutamaterjik nöronları kontrol olarak kullanın ve bunları ko-kültüre paralel olarak tek başına kültürleyin. Bir sonraki adım 3'te açıklandığı gibi her iki koşul için de ikinci bir kayıt yapın.
3. D23'te ikinci bir elektrofizyolojik kayıt yapın (2 günlük ko-kültürden sonra).

Tablo 1: hiPS türevi glutamaterjik nöronlar için kültür ortamı bileşimi.

Bileşen	Tohumlama ortamı	D4 orta	D7 orta	D11 ve sonrası orta
DMEM/F-12 Orta	0,5 kat	0,25 kat	0,125 kat	Ø
Nörobazal Orta	0,5 kat	0,25 kat	0,125 kat	Ø
BrainPhys Ortamı	Ø	0,5 kat	0,75 kat	1 katı
SM1 Takviyesi	1 katı	1 katı	1 katı	1 katı
N2 Ek-A	1 katı	1 katı	1 katı	1 katı
Ala-Gln (GlutaMax)	0,5 milyon	0,5 milyon	0,5 milyon	0,5 milyon
BDNF (BDNF)	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
GDNF (Yurt İçi Finans Santrali	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
TGF-β1	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL
Geltrex Belediyesi	30 μg/mL	Ø	Ø	Ø
Tohumlama Takviyesi	1 katı	Ø	Ø	Ø
4. Gün Takviyesi	Ø	1 katı	Ø	Ø

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
256MEA100/30iR-ITO-w/o	Mcs	256MEA100/30iR-ITO-w/o
Asa sayacı için 40 μm prob	Dutscher	53750
Asa sayacı için 60 μm prob	Dutscher	51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	G8541
Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini	Termo Bilimsel	HERASafe tipi KS12
Kortikal Glutamaterjik Nöronlar	Beyin Xell	BX-0300
DMEM/F12 Orta	Sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
EasYFlaskTM hücre kültürü şişeleri 75cm3	Nunc (Rahibe)	156499
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Dutscher	500105
GDNF (Yurt İçi Finans Santrali	Peprotech teknolojisi	450-10
Geltrex Belediyesi	Yaşam Teknolojileri	A1413201
İnsan BDNF	Peprotech teknolojisi	450-02
kuvöz	Memmert (Türkçe)	IC0150med
MEA2100	Mcs	181205-MEA2100-11240
Mikropipet P10	Sartorius	LH-729020
Mikropipet P100	Sartorius	LH-729050
Mikropipet P1000	Sartorius	LH-729070
Mikropipet P200	Sartorius	LH-729060
Mikrotüp Eppendorf 1,5 ml Güvenli Kilit	Dutscher	33290
Çok Kanallı Deneyci	Mcs	-
N2 Ek-A	Kök Hücre	7152
Nörobazal Orta	Yaşam Teknolojileri	21103049
Neurocult SM1 nöronal takviyesi	Kök Hücre	5711
L-glutamin içermeyen esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)	Dutscher	X0557-100
Pipetör Pipet Yardımı XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Hücre kültürü için pipet 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Hücre kültürü için pipet 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plak şoförü (CultureTemp)	Fransa	370151000
Poli-D-Lizin	Sigma	P6407 Serisi
İlkel mikroskop	Zeiss	415510-1100-000

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi