Fare Hipokampusuna Bir Elektrot Dizisi ve Optik Fiber İmplante Edilmesi

Abstract

Kaynak: Bender, F., et. al., Davranan Farelerde Hipokampal Teta Salınımlarının Optogenetik Sürüklenmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, bir fare modelinin hipokampusuna bir tel elektrot dizisinin ve bir optik fiberin stereotaktik implantasyonunu göstermektedir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Optik Fiberlerin Hazırlanması (Şekil 1A)

1. Çok modlu optik fiber kullanın (105 μm çekirdek, silika çekirdekli cam kaplı, 0.22 NA). Fiber çekirdeğin 125 μm'lik kaplamasını, fiber hala fiber makaraya bağlıyken bir mikro sıyırıcı kullanarak sıyırın.
2. Elyafı bir elmas bıçak kullanarak yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda kesin.
3. Elyafı bir zirkonya seramik çubuk yüksüğe yerleştirin (ID: 126 μm). Optik fiberin yaklaşık 0,5-1 mm'lik kısmı yüksüğün dışbükey tarafından çıkıntı yapmalıdır.
4. Bir iğne kullanarak, yüksüğün her iki ucuna bir damla epoksi yapıştırıcı uygulayın, ancak yüksüğün yanlarına uygulamayın. Alternatif olarak, süper yapıştırıcı kullanın.
5. Tutkalın en az 30 dakika kurumasını bekleyin.
6. Elmas alıştırma fiber parlatma filmi (3 μm irmik) kullanarak yüksüğün dışbükey tarafını cilalayın.
7. Optik güç ölçer kullanarak ışık aktarımının doğruluğunu test edin.
   1. Güç ölçerdeki dalga boyunu, kullanılan lazerle aynı dalga boyuna ayarlayın.
   2. Yama kablosunu, ucu sensörün ortasına bakacak şekilde konumlandırın. Lazeri açın ve güç ölçerden gelen ışık çıkışını okuyun. Değeri kaydedin.
   3. Optik fiberi eşleşen bir manşon aracılığıyla bağlantı kablosuna bağlayın ve fiberin ucu sensörün merkezine bakacak şekilde konumlandırın. Lazeri açın ve güç ölçerden gelen ışık çıkışını okuyun. Değeri kaydedin.
   4. İkinci değeri ilk değere bölerek iletim hızını hesaplayın. İletim hızı 0,5'in altındaysa, fiberi atın; Aksi takdirde, implantasyon için kullanın.
   5. İmplantasyondan önce her lif için iletim hızını test edin.
   6. Daha sonraki deneyler için, lazerin ışık yoğunluğu çıkışını optik fiberin iletim hızına ayarlayın: Fiber ucundan 5-15 mW'lık bir son ışık çıkışı elde etmek için yama kablosu ucundan gelen ışık çıkışını iletim hızına bölünerek 5-15'e ayarlayın.

2. LFP Kayıtları için Tungsten Tel Dizilerinin Hazırlanması (Şekil 1B)

1. Birkaç (örneğin 6) 100 μm silika tüp kılavuzunu bir bant parçasının yapışkan tarafına paralel olarak yapıştırın. Bir tel dizisi montajı için yaklaşık 4-6 mm tek parça kesin.
2. Formvar yalıtımlı 45 μm tungsten telleri forseps kullanarak kılavuz borulardan geçirin.
3. Altı emaye yalıtımlı ince bakır bağlama telini (yaklaşık 5 mm uzunluğunda) ve bir topraklama telini (yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda) her iki uçtaki yalıtımı kazımak için bir neşter kullanarak soyun. Bunları nano konektör pimlerine lehimleyin.
4. Her bir yapıştırma telini, sırasıyla bir damla gümüş iletken boya kullanarak bir tungsten teline bağlayın. En az 30 dakika kurumaya bırakın.
5. Telleri örtmek için minimum miktarda çimento uygulayın. Beyin dokusuna yerleştirilecek olan tungsten tellere veya nano konektörün üst kısmına çimento uygulamayın. Çimentoyu en az 30 dakika kurumaya bırakın.
6. teta genliğinin sürüklenme doğruluğunu tahmin etmek için çok düşük olduğu stratum pyramidale'ye ventral olarak bitişik bölgenin altına veya üstüne tellerin güvenilir bir şekilde implantasyonunu sağlamak için künt paslanmaz çelik makas kullanarak tungsten tellerin açısal bir kesimini (5-20 °) gerçekleştirin.
7. İzolasyonu kazımak için bir neşter kullanarak topraklama kablosunun ucunu (yaklaşık 2 mm) yalıtın. Akı ve ön lehim ile muamele edin.
8. Dijital bir multimetre kullanarak elektrotlar arasındaki olası çapraz bağlantıları kontrol edin. Konektör pimlerini, direnç ölçüm moduna ayarlanması gereken multimetreye bağlayın. Kanalların ikili kombinasyonlarını kontrol edin; multimetrede 5 MΩ'un altındaki bir okuma, önemli çapraz konuşmayı gösterir.
9. Tuzlu sudaki her bir tel elektrotun empedansını kontrol etmek için bir empedans ölçer kullanın. Tipik empedans değerleri 100 kΩ'un altındadır.
10. İmplantasyonu kolaylaştırmak için, bir optik fiberi tel dizisine yapıştırın, böylece fiberin ucu en kısa tel seviyesinde olur ve fiber ucu yakın olur, ancak tungsten tellerine temas etmez. İmplantasyon sırasında doku hasarını önlemek için lifin açısını mümkün olduğunca küçük tutun.

3. Stereotaksik İmplantasyonlar

1. Bağ dokusunu kafatasının üst kısmından çıkarın ve kayıt sırasında kas artefaktlarını önlemek için boyun kaslarını yaklaşık 2 mm aşağı doğru iyice itin.
2. Pamuk uçlu bir aplikatör ve salin kullanarak kafatasını temizleyin ve implantın topraklanması ve stabilizasyonu için kemik paslanmaz çelik vidaları (00-96x1/16) yerleştirmek için dört delik (2'si önde ve ikisi beyincik üzerinde, 0.8 mm çapında) açın (Şekil 1D). Bir bakır tele (yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda) bağlı topraklama vidasını beyinciğin üzerine yerleştirin.
3. Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında kas artefaktlarını önlemek için topraklama vidasını tamamen çimento ile örtün. Tüm vidaları bağlayan bir çimento halkası oluşturun (Şekil 1E).
4. İmplantasyon tarafının üzerinde bir kraniyotomi yapın (Hipokampus, AP -1.94, L 1.4, Bregmaya göre V 1.4). Beyin dokusunun yüzeyine yaklaşık 5 μL steril NaCl uygulayın.
5. Kraniotomide stereotaksi kullanarak tel dizisini yavaşça indirin. Üniter kayıtlar için, bir tel dizisi yerine bir silikon prob implante edin. Optoelektrik ışık artefaktlarını önlemek için, optik fiberi, fiber ucu doğrudan proba bakmayacak şekilde hipokampusa ayrı olarak implante edin (Şekil 1C-I). Hemisferler arasındaki sürüklenmenin koordinasyonunun araştırılması için, kontralateral hipokampal CA1 alanına ek bir optik fiber implante edin.
6. Beyin dokusunu korumak için, implantasyon bölgesinin üzerine bir şırınga ile 70 ° C'de önceden ısıtılmış yaklaşık 5 μL ılık sıvı balmumu / parafin yağı uygulayın.
7. Tel dizisinin etrafına çimento sürün ve kafatasını çimento ile örtün.
8. Önceden lehimlenmiş toprak/referans teline ve topraklama vidasına bağlı önceden lehimlenmiş tele, örneğin bir iğne kullanarak bir damla akı uygulayın ve telleri bir lehimleme makinesi kullanarak sigortalayın.
9. Tüm topraklama kablosunu çimento ile kaplayın.
10. Ameliyattan sonra ve takip eden en az iki gün boyunca 0.3 mL Erycinum (steril NaCl'de 1: 4) ve carprofen (5mg / mL) ip uygulayın. Fare tipik olarak ameliyattan sonraki 15 dakika içinde uyanır. İyileşmeyi hızlandırmak için hayvanı kırmızı bir lamba ile ısıtın.
11. Ameliyattan sonraki ilk hafta veya stabil olana kadar farenin ağırlığını günlük olarak izleyin. Kilo kaybı, ameliyattan önce farenin kaydedilen ağırlığının %10'unu geçmemelidir. Kilo stabilizasyonunu hızlandırmak için, ameliyattan sonraki ilk günlerde fareye ıslak yiyecek ve yoğunlaştırılmış süt verin.
12. Sürüklenme sırasında hipokampal hücresel aktiviteyi kaydetmek için, hipokampusa bir silikon prob yerleştirin (AP -1.94, L 1.4, V 1, daha sonra indirme ile) (Şekil 1C-I). Optik fiberi AP -3, L 1.4, V 1.6, 39 ° kaudal-rostral'da hipokampusa implante edin. Hücre somasının uyarılması isteniyorsa, MS'ye ek bir optik fiber implante edin (AP + 0.98, L 1, V 3.9, 15 ° lateral).

Results

Şekil 1: Optik fiberlerin, elektrotların ve cerrahinin çizimi. (A) Bir optik fiberin çizimi. (B) Hipokampal teta salınımlarının sürüklenmesi sırasında hipokampal LFP'nin kaydedilmesi için bir optik fibere yapıştırılmış bir tel dizisinin gösterimi. (C) Hipokampal hücresel aktivitenin kaydedilmesi için, bir mikro sürücüye bir silikon prob monte edilir. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PV-Cre fareler	Jackson Laboratuvarı	B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Stereotaksi	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, ABD	Ürün Kodu: 963	Ultra hassas küçük hayvan stereotaksik aleti
Matkap uçları, 0,8 mm	Bijoutil, Allschwil, İsviçre	49080HM
Lehimleme istasyonu	Weller Tools GmbH, Besigheim, Almanya	WSD 81
eritromisin	Rotexmedica GmbH, Trittau, Almanya	PZN: 10823932	İnfüzyon çözeltisi için 1 g toz
Hassas matkap/taşlama makinesi	Proxxon, Wecker, Lüksemburg	FBS 240/E
Çok modlu fiber optik	ThorLabs, Dachau, Almanya	FG105LCA	0.22 NA, Düşük OH, Ø105 μm Çekirdek, 400 - 2400 nm
Seramik çubuk yüksük	Hassas Elyaf Ürünleri, Milpitas, CA, ABD	CFLC126	Seramik LC MM Yüksük, ID 126um
Parlatma kağıdı	Thorlab'lar	LF3D	6" x 6" Elmas Lepleme (Parlatma) Sayfası
Güç ölçer	Thorlab'lar	PM100D	Kompakt Güç ve Enerji Ölçer Konsolu, Dijital 4" LCD
Çok modlu fiber optik bağlayıcı	Thorlab'lar	FCMM50-50A-FC	1x2 MM Bağlantı Elemanı, 50:50 Bölme Oranı, 50 μm GI Fiberler, FC/PC
Fiberoptik yama kablosu	Thorlab'lar	FG105LCA ÖZEL MUC	özel yapım, 3 m uzunluğunda, koruyucu borulu, Boru: FT030, Konektör 1: FC / PC, Konektör 2: 1.25mm (LC) Seramik Yüksük
yen	Hassas Elyaf Ürünleri, Milpitas, CA, ABD	ADAL1	Ø1,25 mm (LC/PC) Yüksükler için Seramik Ayrık Eşleşme Kovanı
Tungsten teller	Kaliforniya İnce Tel Şirketi, Grover Beach, CA, ABD	CFW0010954	40 μm, %99,95
Kılcal boru	Optik Sistemler	1068150020	İç çap: 100,4 μm
Omnetics nano bağlayıcı	Omnetics Bağlayıcı Şirketi, Minneapolis, ABD	A79038-001
Vida	Bilaney, Düsseldorf, Almanya	00-96x1/16	paslanmaz çelik
Gümüş iletken boya	Conrad elektronik, Almanya	530042
Sıvı akısı	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Almanya	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)