Hipokampal Ağ Dinamiğinin Optogenetik Kontrolü

Özet

Kaynak: Manseau, F., et al. Hipokampal Teta Bandında İn Vitro Ayarlama: İzole Kemirgen Septohipokampal Devresinden Kayıt Metodolojileri. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, bir fare beyin diliminde genetik olarak değiştirilmiş ışığa duyarlı internöronları aktive ederek, teta salınım senkronizasyonunu geliştirerek ve nöral devre davranışını inceleyerek hipokampal ağ dinamiklerini modüle etmek için optogenetik kullanma yöntemini göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. İzole hipokampusta optogenetik kontrol
   NOT: Hipokampal ağ aktivitesinin optogenetik kontrolü için, PV (parvalbümin pozitif) içeren GABAerjik hücrelerin ritmik aktivasyonunu içeren hücre tipine özgü bir strateji burada kullanılır, çünkü bu hücrelerin izole hipokampustaki ana hücre popülasyonlarını senkronize etmede önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. PV hücrelerinde uyarıcı channelrhodopsin-2'nin (ChR2) seçici ekspresyonu, PV-Cre fare çizgisinin, ChR2'yi Cre'ye bağlı olarak (Ai32) yapısal olarak eksprese eden farelerle çaprazlanması ve böylece PV-ChY fareleri üretilmesiyle elde edilir. Alternatif olarak, viral vektör yapıları (ör., AAVdj-ChETA-eYFP), CA1 / SUB internöronlarında uyarıcı opsin ekspresyonunu yönlendirmek için PV-Cre veya PV-TOM farelerinin (P15-16) hipokampüsüne enjekte edilebilir (Şekil 1A).
   1. CA1 / SUB (Cornu ammonis-1 / subiculum) alanına bir LFP elektrodu yerleştirin ve PV internöronlarında mavi ışığa duyarlı uyarıcı opsin ChR2'yi ifade eden bir farenin izole hipokampüsüne yakındaki bir piramidal hücreyi yamalayın.
   2. Hipokampal preparatın üzerine bir fiber optik ışık kılavuzu (0,2 - 1 mm çapında) yerleştirin ve kaydedilen bölge üzerinde ortalayın. Optogenetik stimülasyon için ışık darbelerinden (10 - 20 ms, bir transistör-transistör mantık sinyali tarafından tetiklenir) veya teta frekanslarında (4 - 12 Hz) verilen sinüs dalgası voltaj komutlarından oluşan bir LED kaynağından gelen mavi ışık (473 nm) kullanın.
   3. Akım kelepçesine geçin ve spontan teta salınımları sırasında piramidal aktivitesini karakterize edin.
   4. Stimülasyon protokolünü başlatın ve ışık tepkilerini kaydedin. Kaydedilen nörondaki alan salınımlarının ve sinaptik aktivitenin, optogenetik stimülasyon sırasında giderek daha fazla senkronize hale geldiğini ve PV hücrelerinin ritmik pacing'inin, teta salınımlarının hem frekansının hem de gücünün sağlam bir şekilde kontrol edilmesiyle sonuçlandığını gözlemleyin (Şekil 1).

Sonuçlar

Şekil 1: İzole Hipokampusta Spontan ve Optogenetik Olarak Yönlendirilen Teta Salınımları Sırasında Tek CA1/SUB Piramidal ve PV Nöronlarından Yerel Alan Potansiyeli ve Eşzamanlı Yama Kelepçesi Kayıtları.

(a) Mavi ışığa duyarlı bir opsin (florofor eYFP ile birleştirilmiş Cheta) ifade eden ışık fiber kılavuzunun CA1/SUB bölgesinin üzerine yerleştirilmesiyle LF...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif
Sodyum Klorür	Sigma Aldrich	S9625 Serisi
Sakaroz	Sigma Aldrich	S9378 Serisi
Sodyum Bikarbonat	Sigma Aldrich	S5761 Serisi
NaH2PO4 - sodyum fosfat monobazik	Sigma Aldrich	S8282 Serisi
Magnezyum sülfat	Sigma Aldrich	M7506
Potasyum Klorür	Sigma Aldrich	P3911 Serisi
D-(+)-Glikoz	Sigma Aldrich	G7528
Kalsiyum klorür dihidrat	Sigma Aldrich	C5080
Sodyum Askorbat	Sigma Aldrich	A7631-25G
ekipman
%95 O2/%5 CO2 gazı karışımı (karbojen)	Canlılık	SG466204A	perfüzyon sistemi
Cam şişeler/mataralar (4 x 1 L)	N.A.	N.A.	perfüzyon sistemi
Batık Kayıt Odası	özel tasarım (FM)	N.A.	Ticari alternatif kullanılabilir
Multiclamp 700B yama kelepçeli amplifikatör	Moleküler cihazlar	ÇOKLU KELEPÇE	Elektrofizyoloji
Multiclamp 700B Komutan Programı	Moleküler cihazlar	ÇOKLU KELEPÇE	Elektrofizyoloji
Dijital/Analog dönüştürücü	Moleküler cihazlar	DDI440	Elektrofizyoloji
Mikromanipülatörler (elle çalıştırılır)	Siskiyou	MX130	elektrofizyoloji (LFP)
Mikromanipülatörler (otomatik)	Siskiyou	MC1000e	Elektrofizyoloji (yama)
Ses monitörü	A-M Sistemleri	Ürün Modelleri 3300	Elektrofizyoloji
Özel yapım dik floresan mikroskobu	Siskiyou	N.A.	Görüntüleme
Analog video kamera	COHU (ÇÖ	4912-2000/0000	Görüntüleme
Görüntüleme yazılımına sahip dijital çerçeve yakalayıcı	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	Görüntüleme
Olympus 2.5x objektif	Olympus	MPLFLN (MPLFLN)	Görüntüleme
Olympus 40x suya daldırma objektifi	Olympus	UIS2 LUMPLFLN	Görüntüleme
Özel yapım ışık yayan diyot (LED) sistemi	töre	N.A.	optogenetik stimülasyon (Amhilon ve diğerleri, 2015)
Hayvan
PV::Cre (KI) fareler	Jackson Laboratuvarı	Stok numarası 008069	PV internöronlarında Cre'ye yönelik gen ekspresyonuna izin verin
Yapısal koşullu Ai9 fareleri (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Jackson Laboratuvarı	Stok numarası 007905	Kre-aracılı rekombinasyonu takiben eksprese TdTomato
Ai32 fareler (R26-lox-stop-lox-ChR2 (H134R) -EYFP	Jackson Laboratuvarı	Stok numarası 012569	Cre rekombinaza maruz kaldıktan sonra geliştirilmiş channelrhodopsin-2 / EYFP füzyon proteinini eksprese edin
PVChY fareler	Ev ıslahında	N.A.	PV-Cre hattının Ai32 fareleri (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP ile melezlenmesinden elde edilen yavrular