Eş Zamanlı Optik Stimülasyon ve Video Kaydı Yoluyla Fonksiyonel Bir Nöromüsküler Kavşağın Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Liberman, M., et al., İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, fonksiyonel nöromüsküler kavşakları değerlendirmek için bir yöntem gösterilmektedir. Floresan mikroskobu ile birlikte kas dokusu ve motor nöronları içeren bir biyoreaktör kullanılarak, nöronlardaki ışığa duyarlı kanallar elektrik sinyalleri üretmek için uyarılır ve kas lifi kasılmalarına neden olur.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Biyoreaktör hazırlığı

1. Biyoreaktör kalıpları yapın
   1. Ek CAD Dosyasından bir biyoreaktör CAD (Bilgisayar destekli tasarım) dosyası indirin veya özel bir tasarım oluşturun.
   2. CAM (Bilgisayar destekli üretim) yazılımını kullanarak 3B modelden bir CNC (Bilgisayarlı Sayısal Kontrol) araç yolu oluşturun.
   3. Bir CNC freze makinesi kullanarak asetal kalıpları işleyin.
2. Biyoreaktörlerin imalatı
   1. Polidimetilsiloksan (PDMS, 4 platform/kalıp başına 77 g karışım) kürleme maddesi karışımı ile 10:1 baz karıştırın.
   2. Karışımı bir vakum odasına koyun, tüm valfleri kapatın, vakumu açın ve hava kabarcığı kalmayana kadar karışımı en az 30 dakika gazdan arındırın. Karışımı kalıplara dökün ve kalıpları 1 saat boyunca vakum odasında gazdan arındırın.
   3. Kalıpları, kalıbın üst yarısı doğru yönde olacak şekilde kapatın. Merkezin üzerine çelik altıgen bir çubuk yerleştirin ve kelepçe her iki tarafta.
   4. Üst kısmı PDMS ile doldurun.
   5. Kalıpları 65 °C fırında en az 4 saat kürleyin.
   6. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra platformları kalıplardan çıkarın.
   7. Cihazları 1 saatlik bulaşık deterjanı, 400 mL %100 izopropanol ve damıtılmış su kullanarak ultrasonik banyoda temizleyin.
   8. Gece boyunca 65 °C'de kurutun.
   9. Cam lamelleri %1 noniyonik yüzey aktif madde poliol içinde 30 dakika bekletin, böylece hepsinin düzgün bir şekilde kaplanması için istiflenmediklerinden emin olun.
   10. Damıtılmış su ile iyice durulayın ve gece boyunca 65 °C'de kurulayın.
   11. Cam lamellere ve PDMS platformuna 1-2 dakika boyunca 6 L/dk oksijen ile yüksekte bir plazma temizleyici uygulayın. Tedavi edildikten sonra, PDMS'yi lamel üzerine en az 30 saniye boyunca bastırarak ikisini birbirine bağlayın.
   12. Hücreleri eklemeden önce bağlı cihazları otoklavlayın.

2. Optik stimülasyon kurulumu oluşturma

1. 30 mm'lik bir kafes küp sistemi kullanarak, merkeze 573 nm'lik bir dikroik ayna takın. Kırmızı bir 627 nm LED'i (Işık Yayan Diyot) 594 nm uzun geçiren uyarma filtresiyle birleştirin ve LED aynaya bakacak şekilde küpün üst tarafına takın. Ardından, Şekil 488A'daki şemada gösterildiği gibi LED aynaya bakacak şekilde küpün bitişik tarafına 546 nm kısa geçiren uyarma filtreli mavi 1 nm bir LED takın.
2. Aydınlatılan alanın boyutunu kontrol etmek için kafes küpünün altına halka tahrikli bir iris diyaframı takın.
3. Her LED'e bir T-Cube LED sürücüsü ile güç verin ve bir Arduino Uno Rev3 kartı ile kontrol edin. LED sürücüsünün yan girişini bir güç kaynağı fişine bağlayın, orta çıkışı Arduino'ya bağlayın ve yan çıkışı doğrudan LED'lere bağlayın.
4. Arduino Uno'yu bir USB kablosuyla bir bilgisayara bağlayın.
5. GitHub bağlantısından dosyaları indirin (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. GitHub klasöründen "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dosyasını açın.
7. Başlangıç parametrelerini ayarlayın: Steps = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Pin çıkışı 4'ün Mavi LED sürücüsüne ve pin çıkışı 2'nin Kırmızı LED sürücüsüne atandığından emin olun. LED sürücüsünün orta kablolarının toprağa ve ilgili pin çıkışına bağlı olduğunu kontrol edin.
9. "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" programını derleyin ve Arduino'ya yükleyin.
10. Her LED sürücüsünü ilgili kanala bağlayın.

>3. Hücre kültürü kurulumu (gün -21-0)

1. Birincil iskelet kası hücreleri
   1. Miyotonik büyüme ortamı (+ takviyesi) kullanarak en fazla altı geçiş için birincil iskelet miyoblastlarını (Cook Myosite'den elde edilir) çözün ve genişletin. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO_2'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
   2. Medyayı 2 günde bir değiştirin.
   3. Hücreler yaklaşık% 60 birleştiğinde,% 0.05 Tripsin-EDTA (1x, 37 ° C'de 5 dakika) kullanarak geçirin. Ayrışmış hücreleri toplayın ve tripsini nötralize etmek için taze ortam ekleyin.
   4. Hücreleri 300 x g'da döndürün ve süpernatanı hücre peletinin üzerine aspire edin.
   5. Hücreleri MGM ile yeniden süspanse edin ve üç katmanlı şişe başına 60 mL ile 1: 3 oranında tohumlayın.
2. ChR2-hiPSC
   not: Bu çalışma için tüm hücre hatları, Columbia Üniversitesi, NY, ABD'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak oluşturuldu ve kullanıldı. Bu protokolde, ChR2 eksprese eden hiPSC'ler, daha önce açıklanan yöntemler kullanılarak CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi yoluyla üretildi18, ancak herhangi bir stabil optogenetik hücre dizisi (lentiviral, piggyBac, vb.) aynı şekilde kullanılabilir. Hem iPSC'lerde hem de motonöronlarda eksprese edilen yapısal promotörler seçildi (CAG). Hücrelerin, önceki yayınlarda belirtildiği gibi sağlıklı karyotiplere sahip olduğu bulundu.
   1. 6 oyuklu plakaları DMEM/F12 (1:80) içinde seyreltilmiş 1 mL/kuyucuklu çözünmüş bazal membran matrisi ile kaplayın ve plakaları oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   2. iPSC'leri 2 mL besleyici içermeyen hücre kültürü ortamı (iPSC ortamı) ile kaplanmış 6 oyuklu plakalara tohumlayın, her gün 2 mL ortam değiştirin ve her 5-7 günde bir geçirin. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO_2'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
   3. Geçiş
      1. Kök hücreleri 1 mL enzim içermeyen kök hücre salgılayan reaktif ile 4 dakika inkübe ederek ve geniş uçlu bir P1000 pipeti ile mekanik olarak keserek ayırın.
      2. iPSC ortamında 1:24 veya 1:48 oranında, 2 μM Y-27632 dihidroklorür ile 2 mL / kuyucuk içinde kaplanmış 6 oyuklu plakalara tohum hücreleri.

4. İskelet kası dokusu tohumlaması (gün -3)

1. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 30 x 106 miyoblastı izole edin ve sayın.
2. Miyoblastları 3 mg / mL kollajen I ve çözündürülmüş bazal membran matrisinin (1 mL'lik bir nihai hacme ulaşmak için 800 μL kollajen karışımı + 200 μL bazal membran matrisi) 4: 1 karışımında yeniden süspanse edin. Kollajen bileşeni için, eşlik eden nötralize edici ajanı (nötralize edici ajana 9:1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
3. Biyoreaktörün her bir kas odasına 15 μL hücre-kollajen süspansiyonu ekleyin, süspansiyonu pipet ucunu kullanarak her iki sütuna da yaydığınızdan emin olun (Şekil 2).
4. Hücre-jel karışımının 37 ° C'de 30 dakika polimerize olmasına izin verin ve ardından her bir biyoreaktörü 450 μL Miyotonik büyüme ortamı ile iyice doldurun.
5. 3 gün sonra (jel sıkılaştıktan sonra), miyotüp farklılaşmasına başlayın.

5. Myotube farklılaşması (0-14. günler)

1. Dokuları 7 gün boyunca 450 μL füzyon indükleyici ortama (FS, Tablo 1) geçirerek miyotüp infüzyonuna başlayın ve ortamı iki günde bir değiştirin.
   not: Her iki hücre tipinin farklılaşma programlarının sonunda motonöronları tohumlamak için hiPSC'lerden motonöron farklılaşması ile aynı gün miyotüp farklılaşmasına başlamaya çalışın.
2. 7. günde ortamı 450 μL olgunlaşma ortamı Ia olarak değiştirin (MMIa, Tablo 1).
3. 9. günde, 450 μL olgunlaşma ortamı Ib'ye geçin (MMIb, Tablo 1).
4. 11. günde, ortamı 450 μL NbActiv4 olarak değiştirin. Motor nöronlar tohumlanana kadar her 2 günde bir ortamı değiştirmeye devam edin (Adım 7).

6. Motonöron farklılaşması (0-14. günler)

1. 0. günde, 4 x 10⁶ ChR2-hiPSC'leri 15 mL motonöron süspansiyon kültürü ortamı içeren ultra düşük bağlantılı bir Petri kabına aktarın (MSCM, Tablo 1). MSCM'yi 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 5 μM Y-27632 dihidroklorür ile destekleyin.
2. 2. günde, nörosferleri (NS) 37 μM geri dönüşümlü süzgeç ile izole edin ve 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 0.1 μM retinoik asit ile 15 mL MSCM'de yeniden plakalayın. 2. günden sonra, NS mikroskop kullanılmadan Petri kabında görünür olmalıdır.
3. 4. günde, hücreleri ve ortamı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve nörosferlerin dibe çökmesine izin verin (5 dakika). Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 ve 0.1 μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden süspanse edin.
4. 7. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 0.5 μM SAG ve 0.1μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden süspanse edin.
5. 9. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak 10 μM DAPT ile desteklenmiş 15 mL MSCM'deki hücreleri yeniden süspanse edin.
6. 11. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden süspanse edin.
7. 14. günde, motonöronları platforma tohumlayın.

7. Biyoreaktörde motonöron agregalarının tohumlanması (14. gün)

1. 2 mg / mL kollajen I ve Matrigel'den (1 mL'lik nihai hacme ulaşmak için 800 μL kollajen karışımı + 200 μL Matrigel) oluşan 4: 1 jel karışımı hazırlayın. Kollajen bileşeni için, eşlik eden nötralize edici ajanı (nötralize edici ajana 9:1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
2. Büyük nöroküreleri seçmek ve bunları jel karışımında yeniden süspanse etmek için 400 nm'lik bir hücre süzgeci kullanın.
3. Ortamı rezervuardan ve dikkatlice nörosfer kuyusundan aspire edin (Şekil 2).
4. Nörosfer kanalına 15 μL jel karışımı ekleyin.
5. 10 μL'lik bir pipeti 10 μL jel ile yükleyin ve ardından bir nörosfer seçin.
6. NS'yi nörosfer kanalına bırakın ve NS'nin odada olduğundan emin olun. NS biriktikten sonra kalan jeli serbest bırakırken pipeti yavaşça kaldırın. NS'nin doğru bir şekilde yerleştirildiğinden emin değilseniz, bir mikroskop kullanarak konumunu kontrol edin.
7. Jelin 37 °C'de 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
8. Rezervuarlara, 20 ng/mL BDNF ve 10 ng/mL GDNF ile desteklenmiş 450 μL NbActiv4 ekleyin.
9. NS'den kas dokusuna aksonal büyümeye izin vermek için ortamı her gün değiştirin.

8. NMJ fonksiyonunun eşzamanlı optik stimülasyonu ve video kaydı (24+ gün)

1. Görüntüleme için, bilimsel bir tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kamera ile ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanın.
2. Kamera yazılımı gruplamasını 2x2'ye, pozlamayı 20 ms'ye, deklanşörü AÇIK'a, okuma hızını 540 MHz'e, dinamik aralık: 12 bit ve kazanç 1'e ve sensör modu: örtüşmeye ayarlayın.
3. Mikro dokuları görüntülemek için mikroskopta 2x objektif kullanın.
4. Mikroskop aşamasına bir canlı hücre odası (37 °C, %5 CO₂) takın.
5. Dosya boyutunu ve işlem süresini en aza indirmek için innerve iskelet dokusu dokusunu içeren ilgili bölgeyi (ROI) seçin.
6. Kameradan gelen mavi ışık darbelerini filtrelemek için numune ile görüntüleme objektifi arasına 594 nm uzun geçiren bir emisyon filtresi yerleştirin.
7. Canlı hücre odasına 4 biyoreaktör (24 doku) içeren dikdörtgen bir 4 oyuklu plaka yerleştirin.
8. Live View'ı (Canlı Görünüm) tıklayın. Görüntüyü istenen yatırım getirisi ile ortalayın ve odaklayın.
9. Sahne konumunu, Arduino kartını ve video alımını kontrol etmek için GitHub klasöründen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) özel makro kodunu yükleyin.
10. Çıkış filmini day_tissue group_tissue name_experiment.nd2 olarak ayarlayın.
11. Makro kodunu, sahne alanında ayarlanan istenen X,Y koordinatlarıyla çalıştırın ve 50 kare/sn'de 1700 kare ile hızlı bir zaman atlaması elde edin.
12. Görüntülemeden sonra ortamı değiştirin ve numuneleri inkübatöre geri koyun. Doku yorgunluğunu önlemek için görüntü alma seansları arasında en az 24 saat bekleyin.

Sonuçlar

Şekil 1. NMJ fonksiyonunun uyarılması, kaydedilmesi ve analizi. (A) LED kurulumu ve ışık yolu şeması. (B) Ters çevrilmiş mikroskop, canlı hücre odası, otomatik sahne ve sCMOS kamera ile optik kurulum. (C) NMJ kültürlerinin optik stimülasyon videolarının toplu işlenmesi için algoritma. (D) MATLAB kodu tarafından oluşturulan videonun te...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre
SkMDC (SkMDC)	Aşçı Miyozit	P01059-14M
Medya ve Takviyeler
İleri düzey DMEM/F12	ThermoFisher Bilimsel	12634-020
Sığır Serumu Albümin çözeltisi	Kırlangıç Sigma	A9576-50ML
G-5 Takviyesi (100X)	ThermoFisher Bilimsel	17503-012
Genetik Selektif Antibiyotik (G418 Sülfat) (50 mg/mL)	ThermoFisher Bilimsel	10131-035
İnsülin, Rekombinant İnsan	Kırlangıç Sigma	91077C-100MG
Matrigel (Matrijel)	Corning	354277
mTeSR Artı	Kök Hücre Teknolojileri	100-0276
MyoTonic Büyüme Medya Kiti	Aşçı Miyozit	MK-4444
N-2 Takviyesi	ThermoFisher Bilimsel	17502-048
NBactiv4 500 mL	Beyin Bitleri LLC	Nb4-500
Nörobazal Orta	ThermoFisher Bilimsel	21103-049
Nörobazal-A Ortamı	ThermoFisher Bilimsel	A13710-01
Plüronik F-127	Sigma Aldrich	P2443 Serisi
ReLeSR	Kök Hücre Teknolojileri	5872
Plastik Gereçler
30 mm kafes küp sistemi	Thor Laboratuvarları	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 ve ER2-P4
37 μm Ters Çevrilebilir Süzgeç, büyük	Kök Hücre Teknolojileri	27250
546 nm kısa geçiren uyarma filtresi	Semrock Belediyesi	FF01-546/SP-25
573 nm dikroik ayna	Semrock Belediyesi	FF573-Di01–25x36
594 nm uzun geçiren emisyon filtresi	Semrock Belediyesi	BLP01-594R-25
594 nm uzun geçiren uyarma filtresi	Semrock Belediyesi	BLP01-594R-25
Lavabo üzerinde Mavi (470nm) Asi LED'PAD-II 10mm Kare Taban - 65 lm @ 700mA	LuxeonStar LED'leri	SP-05-B4
Carclo 29.8° Buzlu 10 mm Dairesel Işın Optik - Entegre Ayaklar	LuxeonStar LED'leri	10413
Corning 60 mm Ultra Düşük Ataşman Kültür Kabı	Corning	3261
Isı emici	LuxeonStar LED'leri	LPD-19-10B
Optik
pluriSüzgeç 400 μm, 25 paket, steril	Çoğul Seçimi	43-50400-03
pluriSüzgeç 500 μm, 25 paket, steril	Çoğul Seçimi	43-50500-03
SinkPAD-II 10mm Kare Taban üzerinde Kırmızı (627nm) Asi LED - 65 lm @ 700mA	LuxeonStar LED'leri	SP-05-R5
halka tahrikli iris diyaframı	Thor Laboratuvarları	SM1D12D
T-Cube LED sürücüleri	Thor Laboratuvarları	LEDD1B, KPS101
Kalıp
Dişi Dişli Altıgen Ayırıcılar, 3 1/2" 10-32, Kısmen Dişli 1/2"	Mcmaster	91920A046
Düşük Profilli C-Kelepçe	Mcmaster	1705A12
Büyüme faktörleri
Adenozin 3",5" siklik monofosfat	Kırlangıç Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris (Türkçe)	4423-10
DAPT 10 mg	Ar-Ge Sistemleri	2634-10
İnsan CNTF, araştırma derecesi, 5 μg	Miltenil Biyotec	130-096-336
İnsan Vitronektin Proteini, CF	Ar-Ge Sistemleri	2349-VN-100
İnsan Vitronektin Proteini, CF	Ar-Ge Sistemleri	2349-VN-100
IGF1 Rekombinant İnsan Proteini	ThermoFisher Bilimsel	PHG0078
Laminin fare proteini, doğal	ThermoFisher Bilimsel	23017015
Rekombinant İnsan Agrin Proteini	Ar-Ge Sistemleri	6624-AG-050
Rekombinant İnsan GDNF Proteini, CF 50ug	Ar-Ge Sistemleri	212-GD-050/CF
Rekombinant İnsan Nörotrofin: 3 100 ug	Hücre Bilimleri	CRN500D
Rekombinant İnsan Nörotrofin-4	Hücre Bilimleri	CRN501B
Rekombinant İnsan Sonik Kirpi/Shh (C24II) N-terminali	Ar-Ge Sistemleri	1845-SH-100
Rekombinant İnsan/Murin/Sıçan BDNF 50 ug	Peprotech teknolojisi	450-02
Retinoik Asit, 50 mg	Kırlangıç Sigma	R2625-50
SAG Düzleştirilmiş Agonist	Kırlangıç Sigma	566660
SB431542 10 mg	Kök Hücre Teknolojileri	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenil Biyotec	130-103-925
İnsan plazmasından vitronektin	Kırlangıç Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihidroklorür	Tocris (Türkçe)	1254
Antikor
α-aktinin mAb (Fare IgG1)	Abcam Belediyesi	ab9465
Kolin Asetiltransferaz (ChAT) (Keçi)	Kırlangıç	AB144P
Desmin mAb (Fare IgG1)	Dako Belediyesi	M076029-2
Miyozin Ağır Zincir (MHC) (Fare IgG2b)	DSHB (Türkçe)	MF20
ekipman
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Otomatik aşama	Uygulamalı bilimsel enstrümantasyon	MS- 2000 XYZ
Genişletilmiş plazma temizleyici	Harrick Plazma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Kontes Otomatik Hücre Sayacı	Mareşal Bilimsel	I-CACC (I-CACC)
IX-81 Ters floresan mikroskobu	Olympus	IX-ILL100LH
Seri Aşama Üst İnkübatör Sistemi	Tokai STX'i Vurdu	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Kamera	Andor Teknolojisi	ZYLA-4.2P-CL10
yazılım
Arduino Yazılımı (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Usta Kamera	Usta Kamera	Solidworks için Mastercam
Matlab (Matematik Laboratuvarı)	Matlab (Matematik Laboratuvarı)	R2021b
NIS öğeleri	Nikon	Temel Araştırma
Solidworks 3D CAD	Solidworks (Solidworks)	Solidworks Standardı