Transmisyon Elektron Mikroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyin Bölümünün Ultrastrüktürel Analizi

Abstract

Kaynak: Lutz, D., et.al. Gelişmekte Olan Fare Beyin ve Omuriliğinin İn Utero Transdüksiyonu Sonrası Ultrastrüktürel Nöroplastisite Parametrelerinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, bir fare yavrusundan alınan bir beyin bölümünün hazırlanması ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizini göstermektedir. Protokol, reçineye gömülü osmiyum tetroksit ile sabitlenmiş doku ile başlar, ardından ilgilenilen bölgeyi izole etmek için hassas kesme ve sırasıyla ışık mikroskobu ve TEM kullanılarak görselleştirilen yarı ince ve ultra ince kesitler üretmek için ultramikrotomi ile devam eder.

Protocol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Kantitatif Analiz için Ultrastrüktürel Nöroplastisite Parametrelerinin Seçimi

1. İlgi alanının haritalanması
   1. Bir ilgi alanı seçin (örneğin, hipokampus veya beyincik) ve bu alanı içeren atlastan görüntüyü seçerek bölüm atlasındaki alanı lokalize edin.
   2. İlgilenilen alanın kenarlıklarını kesit görüntüsüne çizin ve bu bölge kenarlıklarını reçine numunesi üzerine bulun/üst üste koyun.
   3. İnce bir iğne ölçer (26 G, 1 inç) kullanarak reçine numunesi üzerindeki ilgili alanın (örneğin, hipokampus veya beyincik) kenarlarını çizik olarak işaretleyin.
   4. Reçineyi budama için yumuşatmak için reçine örneğini bir fırında 85 °C'ye ısıtın veya alternatif olarak bir düzeltme cihazı, ince bir bıçak veya zımpara kağıdı kullanın.
   5. Reçine örneğinden ilgilenilen alanı bir tıraş bıçağı ile çıkarın. Numuneyi, gerekli kalibrede (örn. 8 mm çapında ve 1 cm uzunluğunda) akrilik camın tutma çubuklarına yapıştırıcı ile monte edin. Yarı ve ultra ince kesit alma için monte edilen numuneyi kesin.
   6. Bir ultramikrotom kullanarak kesilen alanın yarı ince (0,75 μm) ve ultra ince (70 nm) bölümlerini hazırlayın: 0,75 μm kalınlık için 1,5 mm/sn'ye ve 70 nm kalınlık için 0,7 mm/sn'ye ayarlayın.
   7. Yarı ince bölümleri cam taşıyıcılarda toplayın ve bölümleri PBS'de (4 dakika boyunca) %1 toluidin mavisi ile boyayın.
   8. Bölümleri birkaç kez deiyonize suda yıkayın. 4x (NA 0.1 ∞/-), 10x (NA 0.22 ∞/0.17), 40x (NA 0.65 ∞/0.17) ve 100x (NA 1.25 ∞/0.17) kullanarak lekeli bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin.
   9. Nikel ızgaralarda ultra ince kesitler toplayın. Izgaraları 180 kV'ta ve 3.200x, 6.000x ve/veya 8.000x büyütmede TEM'e tabi tutun.
2. TEM Analizi
   1. Kantitatif TEM analizi için ilgilenilen ultrastrüktürel parametreleri seçin (örneğin, veziküllü ve mitokondrili butonlar veya miyelinli ve miyelinli olmayan aksonlar) ve bu parametrelerin 3.500x, 6.000x ve/veya 8.000x büyütme altında TEM görüntülerini alın.

Materials