Fare Hipokampal Nöronlarında Sinaptik Vezikül Endositozunun Transmisyon Elektron Mikroskobik Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Villarreal, S., et. al., Kültürlenmiş Hipokampal Nöronlarda Sinaptik Vezikül Endositozunun Ölçülmesi. (2017)

Bu video, yaban turpu peroksidaz etiketlemesi ve elektron mikroskobu yoluyla kültürlenmiş hipokampal nöronlarda sinaptik vezikül endositozunun analizini göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

Elektron Mikroskobu

1. 31.5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7.4), 30 mM glikoz, 2 mM MgCl₂, 0.01 mM CNQX, 0.05 mM AP5 ve 5 mg / mL HRP olarak HRP (yaban turpu peroksidaz) ile yüksek bir K ⁺ stimülasyon çözeltisi hazırlayın, ardından 5 M NaOH ile pH 7.4'e ayarlayın.
   1. Hipokampal nöron kültürünü, 90 s boyunca her bir oyuğa 1.5 mL ilave ederek oda sıcaklığında (K ⁺ olarak adlandırılır) 1.5 mL yüksek K ⁺ stimülasyon çözeltisi ile uyarın. Dinlenme durumunda (R olarak adlandırılır), 90 s boyunca aynı konsantrasyonda 5 mg / mL HRP uygulayın, ancak normal tuzlu su çözeltisi ile. Geri kazanım numunesi için, K ⁺ numunesinde olduğu gibi yüksek K ⁺ stimülasyon solüsyonu uygulayın, ardından hızlı bir şekilde yıkayın ve normal salin ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
2. Fiksasyon ve boyama
   
   1. pH 7.4'te 21.4 g/L Na koidilat kullanarak 0.1 M Na koidilat tamponu hazırlayın. Hücreleri% 4 glutaraldehit ile 0.1 M Na kakodilat tamponunda oda sıcaklığında en az 1 saat sabitleyin. Her biri 7 dakika boyunca 0.1 M Na kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın.
   2. ddH₂O'da% 0.3 H₂O₂ ile 0.5 mg / mL DAB'den oluşan Diaminobenzidin (DAB) çözeltisi hazırlayın ve 0.22 μm'lik bir filtre ile süzün. 37 ° C'de 30 dakika boyunca 1.5 mL DAB solüsyonu uygulayın. Her biri 7 dakika boyunca 0.1 M Na kkodilat tamponu ile üç kez yıkayın.
      DİKKAT: DAB toksik ve şüpheli bir kanserojendir. Lütfen eldiven ve laboratuvar önlüğü kullanın.
      NOT: DAB ile etiketleme, HRP tarafından katalize edildiği gibi H₂O₂ ile oksidasyonu nedeniyle oluşur. Bileşenlerdeki küçük artışlar, numunede sinyalin artmasına neden olur. HRP konsantrasyonunun arttırılması, katalizörün etkisini hızlandırır. Yeterince yüksek H₂O₂ konsantrasyonları, HRP ile zayıflatıcı yan reaksiyonlara izin verir ve³² etiketlemenin etkisini engeller. Bu çalışmada, bu etiketleme sisteminin konsantrasyonları şu anda mevcut olan araştırmalara dayanarak seçilmiştir.
   3. Nöronları, fiksasyon sonrası olarak 4 ° C'de 1 saat boyunca 0.1 M Na kakodilat tamponunda 1.5 mL% 1 OsO₄ ile inkübe edin. Her biri 7 dakika boyunca 1,5 mL 0,1 M Na kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın.
      DİKKAT: OsO_4'ün toksisitesi ve reaktivitesi nedeniyle, numuneyi kimyasal bir başlıkta buz üzerinde tutmak birçok durumda inkübasyon için bir buzdolabı kullanmaya tercih edilir.
   4. pH 5.0'da 13.61 g/L sodyum asetat ve 11.43 mL/L buzlu asetik asit ile 0.1 M sodyum asetat tamponu hazırlayın. 1.5 mL, 0.1 M asetat tamponu ile pH 5.0'da her biri 7 dakika boyunca üç kez yıkayın ve pH 5.0'da 0.1 M asetat tamponunda 1.5 mL% 1 uranil asetat ile 4 ° C'de 1 saat inkübe edin. Her biri 7 dakika boyunca 1.5 mL 0.1 M asetat tamponu ile üç kez yıkayın.
      
3. Epoksi embedding
   
   1. Nöron kültürünü, her birinde 7 dakika boyunca %50, %70 ve %90 etanol içeren tek 1.5 mL yıkama ile ve ardından çeker ocakta her biri 7 dakika boyunca 3 mL 1.5 mL %100 etanol yıkama ile kurutun.
   2. 485 mL/L bisfenol-A- (epiklorhidrin) epoksi reçinesi, 160 mL/L dodekenil süksinik anhidrit (DDSA), 340 mL/L Metil-5-Norbornen-2,3-Dikarboksilik Anhidrit (NMA) ve 15 mL/L 2,4,6-tris (dimetilaminometil) fenol (DMP-30) epoksi reçinesini oluşturmak için. İyice karıştırın, ardından hava kabarcıklarını gidermek için vakum altında saklayın.
      NOT: Reçinedeki hava kabarcıklarının, özellikle çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük olanların çıkarılması çok önemlidir, çünkü bunlar kesit alma sırasında reçinede boşluklara neden olabilir.
   3. Etanolü bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca etanol içinde% 50 epoksi reçine ile, ardından bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca etanol içinde% 70 epoksi reçine ile değiştirerek numuneyi sızatın.
   4. Epoksi reçine çözeltisini %100 epoksi reçine ile değiştirin ve 50 °C'de 10 dakika inkübe edin. 50 °C'de 1 saat inkübasyonlu iki adet taze %100 epoksi reçine değişimi gerçekleştirin. Taze %100 epoksi reçine ekleyin ve gece boyunca 50 °C'de ve ardından sertleşmesi için 36 saatten fazla 60 °C'de sertleşmeye bırakın.
4. Her bir numuneyi bir kuyumcu el testeresi ile muti-well plakasından çıkarın. Ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak ilgilenilen bölgeleri, yoğun hücre konsantrasyonlarını seçin ve ardından mikrotom ile kesit almak için 70 ila 80 nm blokları kesin. Kesilen bölgeyi mikrotom aynasına monte edin ve mikrotomu yükleyin. Mandreni mikrotomun içine yerleştirin ve kenarı bloğun yüzeyine paralel olacak şekilde bir elmas bıçak monte edin. 70 ila 80 nm kalınlığındaki bölümleri doğrudan ayrı ızgaralara toplayın.
5. Uranil asetatı ağırlıkça %1'lik bir çözelti için suda çözün ve kurşun sitratı ağırlıkça %3'lük bir çözelti için suda ayrı ayrı çözün. Numunelerin kontrastını iyileştirmek için bölümleri 15 dakika boyunca %1 sulu uranil asetat ve ardından 5 dakika boyunca %3 sulu kurşun sitrat ile daldırarak boyayın.
6. EM imaging
   1. Transmisyon elektron mikroskobu ile kesitleri inceleyin ve görüntüleri 10.000-20.000X birincil büyütmede bir CCD dijital kamera ile kaydedin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Neurobazal medium	Thermo Fisher	21103-049	Nöron için büyüme ortamı, kullanmadan önce 37°C'ye kadar ısıtın
B27	Thermo Fisher	17504-044
Nöronal farklılaşma için gradyan
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradient for neuronal culture
Sığır pankreazından Tripsin XI	Sigma	T1005	Neuronal culture-digest hippocampal tissues
sığır pankreasından Deoksiribonükleaz I	Sigma	D5025	Neuronal culture-inhibits viscous cell süspansiyonu
Poly-l-lysine	Sigma	P4832	Elektron mikroskobu, nöronal büyüme için substrat, oda sıcaklığında 1 saat boyunca çok kuyulu plakaya uygulayın, ardından 3 kez sterilize su ile yıkayın
Horseturp peroxidase(HRP)
P6782	Elektron mikroskobu, hidrojen peroksit varlığında DAB'yi katalize ederek endositozlu sinaptik veziküllerin etiketlenmesi, normal salinde nihai konsantrasyon 5 mg / mL'dir, kullanmadan
Sodyum kakodilat	Electron Microscopy Sciences	12300	Elektron mikroskobu, fiksatifler ve yıkama için tampon, son konsantrasyon 0.1 N
3,3"-Diaminobenzidine(DAB)	Sigma	D8001	Elektron mikroskobu, endositozlu sinaptik veziküllerin etiketlenmesi, HRP için substrat, nihai konsantrasyon DDW'de 0.5 mg/mL'dir ve filtrelenmiştir, kullanmadan önce taze yapın
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009	Elektron mikroskobu, HRP-DAB reaksiyonunu indükleyerek endositozlu sinaptik veziküllerin etiketlenmesi, DDW'de nihai konsantrasyon %0.3'tür, kullanmadan
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16365	Elektron mikroskobu, fiksatifler, Na-kakodilat tamponunda nihai konsantrasyon %4'tür, kullanmadan önce tazeleyin, kullanmadan önce iyice çalkalayın
TEM	JEOL	200CX	Elektron mikroskobu, endositozlu veziküllerin görüntülenmesi ve ultrastrüktürel değişiklikler
CCD digital camera	AMT	XR-100	Elektron mikroskobu, görüntü yakalama
Kurşun sitrat	Leica microsystems	16707235	Elektron mikroskobu, ızgara boyama

Sigma önce taze yapınönce taze yapın