Transgenik Bir Farede Nöroinflamasyonun Biyolüminesans Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Breid, S., et. al. Alfa-sinüklein Fibrillerinin Periferik Aşılanmasından Sonra Transgenik Farelerde Nöroinflamasyonun Biyolüminesans Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, transgenik farelerde nöroinflamasyonun biyolüminesans görüntülemesini göstermekte ve aktive edilmiş astrositlerde lusiferaz-lusiferin reaksiyonlarını göstermektedir. Protokol, astrositik aktivasyonun non-invaziv olarak ölçülmesini sağlayarak CNS inflamasyonu ve terapötik etkinlik üzerine çalışmalara yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Hayvan Modeli

1. Gfap-luc+/-) fareleri ile hemizigot Tg(M83+/-) fareler hemizigot bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) fareler oluşturmak için.
2. İnsan alfa-sinükleinini kodlayan transgen kodlayan gerçek zamanlı PCR ve ateşböceği lusiferaz için standart PCR ile soyları genotipleyin.
3. Hayvanları altı ila sekiz haftalıkken aşılayın.

İnokulum Hazırlama

1. {{}}20 mM Tris-HCl'de (pH 7.2) 150 mM NaCl içeren Tris-tamponlu salin (TBS) tamponunda A53T mutasyonu ile monomerik rekombinant insan alfa-sinükleini hazırlayın.
2. 5 gün boyunca 800 rpm ve 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcıda 3 μg / μL monomerik rekombinant insan alfa-sinükleini çalkalayarak aşılamalar için fibriller alfa-sinüklein hazırlayın.
3. İntraperitoneal aşılamalar için 1 μg / μL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için fibril düzeneklerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltin.
4. Alfa-sinüklein fibrillerini bir çubuk sonikatör ile 1 dakika boyunca parçalayın (her darbe arasında bir saniyelik duraklama ile 0.5 s süreli 40 darbe ve genlik% 50'ye ayarlanmış). Çapraz tohumlama ile kontaminasyonu önlemek için. Farklı inokülum hazırlamak için temiz sonikasyon probları kullanın.

İntraperitoneal Enjeksiyonlar

1. İntraperitoneal enjeksiyonlar için, hayvanları 2 L/dk'lık bir akış hızı ve buharlaştırıcı %2'ye ayarlanmış izofluran/oksijen ile soluyarak bir anestezi odasında kısa süre uyuşturun. Hayvanın ayak parmağını sıkıştırın ve uygun anesteziyi sağlamak için arka ayağını çekmediğini onaylayın.
2. 27 G tek kullanımlık hipodermik şırıngayı 50 μL sonikasyonlu alfa-sinüklein fibrilleri veya PBS ile doldurun.
3. Doğrudan farenin peritonuna enjekte edin ve hayvanı, başı araştırmacıdan uzağa ve yaklaşık 45 ° 'lik bir açıyla aşağı bakacak şekilde sırt pozisyonunda tutarak karın duvarının arkasında bulunan ince bağırsağa veya çekuma nüfuz etmekten kaçının. Anesteziden kurtulana kadar hayvanları izleyin.

Biyolüminesans Görüntüleme

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) fareler her 2-4 haftada bir.
2. Görüntülemeden kısa bir süre önce, fareleri 2 L/dk akış hızına sahip ve buharlaştırıcı %2'ye ayarlanmış bir izofluran/oksijen odasında anestezik hale getirin. Hayvanın ayak parmağını sıkıştırın ve uygun anesteziyi sağlamak için arka ayağını çekmediğini onaylayın.
3. Farelerin kafalarını tüy dökücü bir kremle tıraş edin ve epilasyon yapın. Spesifik olmayan biyolüminesansı engellemek için kulakları tahriş edici olmayan bir işaretleyici ile siyaha boyayın.
4. Lusiferazın substratı olan D-lusiferin potasyum tuzunu PBS'de 30 mg / mL'lik bir stok çözeltisine seyreltin. Bunu -20 ° C'de 1 mL alikotlarda saklayın. Çözünmüş D-lusiferini ışığa maruz kalmaktan koruyun.
5. Enjeksiyondan önce hayvanları tartın. 150 mg / kg vücut ağırlığı enjeksiyonu için tam D-lusiferin hacmini hesaplayın. İntraperitoneal olarak D-lusiferin enjekte edin ve hayvanı anestezi odasına geri koyun.
6. Görüntüleme yazılımını başlatın. Görüntüleme sistemi çalışma sıcaklığına ulaştıktan sonra, kontrol panelindeki 'Başlat' düğmesine tıklayarak sistemi başlatın.
7. 'Lüminesan' ve 'Fotoğraf' düğmelerini seçin. Pozlama süresini 60 s'ye, gruplamayı 'Orta'ya, F/Stop'u '1'e ve EM kazancını 'Kapalı' olarak ayarlayın.
8. Uyarma filtresinin 'Engelle' ve emisyon filtresinin 'Açık' olarak ayarlandığını onaylayın ve konu yüksekliğini 1,50 cm olarak ayarlayın.
9. D-lusiferin enjeksiyonundan on dakika sonra, hayvanları görüntüleme odasındaki ısıtma plakasına yerleştirin ve ağızlıklarının anestezi çıkışına doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. İnhalasyon odasından izofluran/oksijen akışını kapatın ve 0,25 L/dk akış hızı ve %2'lik bir buharlaşma ile görüntüleme odası için akışı açın. Görüntüleme odasının kapısını düzgün bir şekilde kapatın.
10. 60 saniye süren biyolüminesansı ölçmek için 'Elde Et' düğmesine tıklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
27-gauge syringe	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Depilasyon kremi	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferin potassium salt	Acris	LK10000	30 mg/mL stok solution
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) fareler veya B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J fareler	The Jackson Laboratory	4479<

td style='width:135pt;'>