Floresan lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının retrograd etiketlenmesi

Özet

Kaynak: İnal, M. A. et. al., Lipofilik Floresan Boyalar Kullanılarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronlarının Retrograd İzlemesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının geriye dönük etiketleme yöntemini göstermektedir. Boya aksona girer, geriye doğru hareket eder ve nöronları yeşil olarak etiketleyerek morfolojilerinin ve projeksiyonlarının konfokal bir mikroskop altında ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

1. Equipment and Supplies

1. Embriyoları toplamak ve yetişkinleri yumurtlamak için eğitmek için malzemeler
   1. 50 mL'lik bir tüpü keserek ve 100 μm gözenekli bir ağ filtre ayarlamak için kapakta bir delik açarak filtrasyon aparatını hazırlayın (Malzeme Tablosu) tüp ile kapak arasında.
      NOT: Alternatif olarak, embriyo toplamanın filtrasyon adımı için 100 μm gözenekli hücre süzgeçleri (Malzeme Tablosu) kullanılabilir.
   2. Listelenen talimatlara göre üzüm agar premiksi (Malzeme Tablosu) ile agar plakaları yapın. Kısaca, bir paket toz karışımını 500 mL oda sıcaklığında (RT, 23 °C) damıtılmış suya (dH₂O) hafifçe karıştırın ve çözünmüş karışımı mikrodalgada kuvvetli bir kaynama noktasına getirin. 70−75 °C'ye kadar soğuduktan sonra karışımı Petri kaplarına (60 mm) dökün. Agar katılaştıktan sonra plakaları 4 °C'de saklayın.
   3. Aktif kuru mayayı (Malzeme Tablosu) ve suyu macun kıvamına gelene kadar karıştırarak maya hamurunu hazırlayın ve 4 °C'de tutun.
   4. Yeterli hava akışı sağlayan yumurta toplama kafesleri (60 mm Petri kabı, Malzeme Tablosu için) kullanın.
      
2. Diseksiyon iğnelerinin ve boya enjeksiyon mikropipetlerinin hazırlanması
   1. İç çapı 0,6 mm ve dış çapı 1,2 mm olan aynı kılcal borudan boya enjeksiyon mikropipeti ve diseksiyon iğnesi hazırlayın (Malzeme Tablosu). ~ 0,4 cm uzunluğunda bir konikliğe sahip keskin bir iğne oluşturmak için kılcal boruyu 7 V maksimum çıkıştan (Malzeme Tablosu) %170'lik bir mikropipet çektirme ile çekin.
   2. Boya enjeksiyonu için, mikropipeti, cihazın kılavuzunda açıklanan bir kabarcık eğim verme tekniği ile eğimli bir mikropipet (Malzeme Tablosu) ile ayarlayın.
      1. Kısacası, suyun iğne ucunu 'sürüklemesini' önlemek için öğütücüyü bir ıslatıcı madde (Malzeme Tablosu) ile ıslatın. İğneyi mikropipet kelepçesine 25−30°'de yerleştirin ve ucu, eğim verme yüzeyinin merkezinden yarıçapın üçte ikisine indirin. Mikropipetin cam talaşlarından arınmış olmasını sağlamak için borulu bir şırınga iğneye hava iterken iğneyi öğütün.
      2. Açılı olarak oluşturulan mikropipetin dar açıklığını bulmak zor olduğundan, eğim verdikten sonra uçtaki açıklığın konumunu belirtmek için mikropipeti ince uçlu kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.

2. Embriyo Toplama

1. Hazırlığı İdeal yumurta toplama için yetişkin sineklerin (20−40 vahşi tip Kanton-S veya beyaz sinekler), genç (<7 gün) ve sağlıklı koşullarda muhafaza edildiğinden emin olun.
   NOT: Yumurtlamayı teşvik etmek için sinekler, yumurta toplamadan birkaç gün önce yumurta toplama kafeslerinde, maya macunu ile çizgili agar plakalarında en az bir kez eğitilir.

3. Embryo Staging

1. Sineklerin RT'de gece boyunca (veya en az 15 saat) yumurtlamasına izin verin, böylece yumurta yumurtlamasından (AEL) 15 saat sonra, yani aşama 16, ön köşe hücresi (aCC) ve ham karides 3 (RP3) motor nöronlarının dendritogenezini görmek için. Sabahları tabağı yumurtalarla birlikte toplayın.
   NOT: 15 saat AEL'deki embriyolar belirgin bir 4 odacıklı bağırsağa sahip olacaktır. Görüntüleme için, farklı aşamalar kendi özel morfolojik kriterlerini ve yaşlanma koşullarını takip eder.
2. Embriyoları toplamak için tabağa konulan yumurtaları %50 çamaşır suyu ile 5 dakika boyunca dekoryonlayın.
3. Koryonlar temizlendikten sonra, embriyoları izole etmek için plakanın içeriğini filtrasyon aparatından veya hücre süzgecinden dökün. Bir şişe su sıkarak, tabakta kalan ağartıcıyı seyreltin ve karışımı filtreye boşaltarak mümkün olduğunca çok embriyo toplayın.
4. Filtredeki embriyoları 3−4x daha fazla su ile veya çamaşır suyu kokusu dağılana kadar yıkayın. Filtreyi cihazdan çıkarın ve embriyoları suyla başka bir temiz tabağa yıkayın. Embriyoların üzerinde bulunduğu yeni plakadan suyu boşaltın.
5. Bir dikdörtgen oluşturacak şekilde ortasından iki kat vinil bantla kaplayarak bir cam slayt hazırlayın. Bir tıraş bıçağı kullanarak banttan dikdörtgen bir havuz kesin. Havuzun üst ucuna doğru ince bir çift taraflı bant şeridi yerleştirin, burası Şekil 1'de gösterildiği gibi embriyoların yerleştirileceği yerdir.
6. İnce forseps kullanarak, 15 saat AEL'de 5−10 embriyoyu tek tek seçin ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde çift taraflı bant üzerine yerleştirin. Embriyoları kurumaya karşı korumak için diseksiyon havuzuna böcek Ringer salini ekleyin (Şekil 1).

4. Diseksiyon ve Boyama

1. Diseksiyon mikroskobu altında (Malzeme Tablosu) bir cam iğne kullanarak, yüzeyindeki tek bir embriyonun orta hattını arka ucundan ön ucuna kadar kesin. Daha sonra embriyoyu vitellin zarından banttan camın üzerine sürükleyin (Şekil 1'de kutulanmıştır). Embriyonun iç dokularına zarar vermemeye özen gösterin.
2. Epitel dokularını merkezden çevirin ve epidermal kenarı cam sürgünün yüzeyine yapıştırın (Şekil 1, iç kısım).
3. ~300 μm uç açıklığına sahip tüp bağlantılı bir iğne kullanarak (bir diseksiyon iğnesinin ince ucunu kırarak hazırlanır), dorsal longitudinal trakeal gövdeleri ve kalan bağırsakları ayırmak ve çıkarmak için hava aspire edin veya üfleyin.
4. Embriyoları RT'de 5 dakika sabitlemek için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4 paraformaldehit (PFA) kullanın. Embriyoları PBS ile 3x yıkayın.
5. Embriyoları 1 μL anti-yaban turpu peroksidaz antikoru ile cyanine 3 boya (anti-HRP Cy3) (Malzeme Tablosu) ile 200 μL PBS'de 1 saat boyunca boyayın. Boyamadan sonra embriyoları PBS 3x ile yıkayın.
   NOT: Anti-HRP boyası, enjeksiyon için tercih edilen lipofilik boyalara göre değiştirilebilir.

5. Enjeksiyonun Doldurulması Micro-pipette

1. Heat lipofilik boyalar (5 mg / mL 3,3'-dioktadesiksakarbosiyanin, perklorat (DiO) veya 1,1'-dioktadesil-3,3,3",3" - tetrametilindodikarbosiyanin, 4-klorobenzensülfonat tuzu (DiD), Malzeme Tablosu) kullanmadan önce 1:10 etanol karışımında 60 ° C'ye kadar: bitkisel yağ.
2. Enjeksiyon mikropipeti için yağda çözünmüş bir boya lamı hazırlayın. Mikropipeti kılcal tutucuya yerleştirin (Şekil 2, #1). Mikromanipülatörü (Malzeme Tablosu) kullanarak, mikropipeti boya lamının üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Ardından, mikropipeti boyanın üzerine yerleştirmek için sahneyi ayarlayın (Şekil 2, #2).
3. Mikropipeti doldurmak için bir mikroenjektör kullanın (Malzeme Tablosu) (Şekil 2, #3). P_i (enjeksiyon basıncı) 200−500 hPa (hektopaskal), T_i (enjeksiyon süresi) 0.1−0.5 s ve P_c (dengeleme basıncı) arasında 0 dakika boyunca 5 hPa'ya ayarlayarak boyayı mikropipette toplayın (Şekil 2, #4).
4. Boya toplandıktan sonra, boya slaytını çıkarın ve numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. Ardından, PBS'nin kılcal hareketle kontaminasyonunu önlemek için mikropipeti numuneye indirmeden önce Pc'yi 20-60 hPa aralığına yükseltin.

6. Nöronlara

1. Boya Enjeksiyonu10x objektif lensli mikroskop kullanarak embriyoyu merkeze yerleştirin (Malzeme Tablosu) ve mikropipeti embriyo ile hizalayın.
   NOT: Boya damlacığının boyutu, Pi değeri veya mikropipet ucunun açıklığının boyutu değiştirilerek ayarlanabilir. Damlacık 10−20 μm olmalıdır, bu da yaklaşık olarak 1 kas genişliğindedir.
2. Objektif lensi suya daldırılan 40x lense (Malzeme Tablosu) değiştirin ve embriyoyu görmek için lensi PBS'ye daldırın.
   1. Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronal morfolojiyi kontrol etmek ve enjeksiyon bölgesini belirlemek için floresan mikroskobu kullanın.
   2. Enjeksiyon sırasında, boya damlacığını görmek için parlak alan mikroskobu kullanın. Embriyo odakta olduğunda, ilgilenilen aksonun ucuyla (örneğin, aCC, RP3) hafifçe temas etmek için mikropipetin konumunu değiştirin.
   3. Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronları kullanarak, boyayı aCC veya RP3'ün nöromüsküler kavşağındaki sağ abdominal (A2−A6) hemi segmentine DiD veya DiO ile bırakın. El kumandasını kullanarak (fare; Şekil 2, 5) boyayı mikromanipülatör ile düşürdükten sonra boyayı serbest bırakın ve mikropipeti çıkarın ve bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin.
      NOT: Boşluk bağlantıları yoluyla komşu hücrelere yayılan diğer boyaların (örneğin, Lucifer sarısı, kalsein) aksine, lipofilik boyalar hücre zarlarıyla ilişkilidir ve komşulara aktarılmaz. Bununla birlikte, boya damlacığının nispeten büyük boyutu nedeniyle, bu teknik aynı zamanda ortak kasların etiketlenmesiyle de sonuçlanır (Şekil 3A).
3. Görüntülemeden önce boya damlasından sonra numuneyi RT'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: Protokol montajdan önce burada duraklatılabilir ve numune gece boyunca 4 °C'de tutulabilir. Lipofilik boyalar, hücre içi doğrudan bağlı (DC) bir amplifikatör hazırsa iyontoforez kullanılarak da verilebilir.

7. Konfokal Mikroskopla Görüntüleme

1. Forseps yardımıyla çift taraflı bandı ve vinil bandı cam slayttan çıkarın.
2. Dört köşesinde az miktarda vakumlu gres (Malzeme Tablosu) bulunan bir kapak fişi (22 x 22 mm2 No.1 kapak camı) hazırlayın ve hava kabarcıklarını önleyerek numunenin üzerine dikkatlice yerleştirin. Görev silicilerini kullanarak fazla PBS'yi kaldırın.
3. Objektif lens ile sample arasındaki çalışma mesafesini ayarlamak için lamel aşağı itin. Lamelin kenarlarını oje ile tamamen kapatın.
4. Konfokal mikroskop kullanılarak 10x ve 100x büyütmede görüntü.

Sonuçlar

Şekil 1: Diseksiyon havuzunun kurulumu. Cam slayt üzerinde görülen mavi oda, tamponları içeride tutan vinil bant ile oluşturulmuştur. Çift taraflı bant, uygun şekilde hizalanmış embriyoları tutar. Ayrıca sol alt köşede, salin ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10x objektif lens	Nikon		Plan
40x suya daldırma lens	Nikon		NIR Apo
Kılcal boru	Frederick Haer&Co	27-31-1
Konfokal mikroskop	Andor	N/A<
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Diseksiyon mikroskobu	Nikon	N/A<
Çift taraflı bant	Scotch	665
Dow corning yüksek vakumlu gres	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Güzel Bilim Araçları	11252-20
Yumurta toplama kafesi	FlyStuff	59-100<
FemtoJet 5247	Eppendorf	durduruldu	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
İğne çektirme	Narishige	PC-100
Nutri-fly üzüm agar tozu premix paketleri	FlyStuff	47-102
Naylon ağ filtresi	Millipore
Paraformaldehit %16 solüsyon, EM grade	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	sigmaaldrich'te satılır, kutulu 10x çözüm
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Dik floresan mikroskobu	Nikon	N/A<
Vinil elektrik bandı	Scotch	6143
VWR Cell strainers	VWR	10199-659
Maya	FlyStuff	62-103	Aktif kuru maya (KIZIL YILDIZ)

td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Dragonfly Spinning disk konfokal ünitesitd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>SMZ-Utd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>LED ışık kaynaklı Eclipse Ci